第二节　发酵工业培养基的设计

一、发酵培养基设计的目的

不同微生物对培养基的需求是不同的，不同的发酵生产所需要的原料也不同。工业生产上选用的培养基，必须根据生产菌的营养特性和生产工艺的要求来进行选择。一个合适的培养基，应该能够充分满足生产菌生长、代谢的需求，能达到高产、高质、低成本的目的，其选择的一般原则如下：

（1）能够满足生产菌的生长、代谢的需要　各种生产菌对营养物质的要求不尽相同，有共性，也有各自的特性，且每种生产菌对营养物质的要求在生长、繁殖阶段与产物代谢阶段有可能不同。实际生产中，应根据生产菌的营养特性、生产目的来考虑培养基的组成。

（2）目的代谢产物的产量最高　氨基酸发酵生产上，生产菌的氨基酸代谢量与培养基组成有较大关系。在满足生产菌的生长、代谢需求的前提下，应选择能够大量积累代谢产物的培养基，以达到产量最高的目的。

（3）产物得率最高　产物得率高低与生产菌株的性能、培养基的组成以及发酵条件有关，对于某一菌株在某种发酵条件下，培养基的选择十分重要。底物能够最大限度地转化为代谢产物，有利于降低培养基成本。

（4）生长菌生长及代谢迅速　保证微生物在所选的培养基上生长、代谢迅速，能够在较短时间内达到发酵工艺要求的菌体浓度，并能在较短时间内大量积累代谢产物，可有效地缩短发酵周期，提高设备的周转率，提高产能。

（5）减少代谢副产物生成　培养基选择适当，有利于减少代谢副产物的生成。代谢副产物生成量最小，可最大限度地避免培养基营养成分的浪费，并使发酵液中代谢产物的纯度相对提高，对产物的提取操作和产品的纯度有利，同时可降低发酵成本和提取成本。

（6）廉价并具有稳定的质量　选择价格低廉的培养基原料，有利于降低发酵生产的培养基成本。同时，也应要求培养基原料的质量稳定。因为工业规模发酵生产中，培养基原料质量的稳定性是影响生产技术指标稳定性的重大因素之一。特别是对于一些营养缺陷型菌株，培养基原料的组分、含量直接影响到菌体的生长，若原料质量经常波动，则发酵条件较难确定。

（7）来源广泛且供应充足　培养基原料一般采用来源广泛的物质，并且根据工厂所在的地理位置，选择当地或者附近地域资源丰富的原料，最好是一年四季都有供应的原料。一方面，可保证生产原料的正常供应，另一方面可降低采购、运输成本。

（8）有利于发酵过程的溶解氧及搅拌　氨基酸发酵是好氧发酵，主要采用液体深层培养方式，在发酵过程中需要不断通气和搅拌，以供给微生物生长、代谢所需的溶解氧。培养基的黏度等直接影响到氧在培养基中的传递以及微生物细胞对氧的利用，从而会影响发酵产率。因此，选择培养基还应考虑这方面的因素。

（9）有利于产物的提取及纯化　培养基杂质过多或存在某些对产物提取具有干扰的成分，不利于提取操作，使提取步骤复杂，导致提取率低、提取成本高、产物纯度低等。因此，选择发酵培养基时，也要考虑发酵后是否有利于产物的提取。

（10）废物的综合利用性强，且处理容易　提取产物后的废液是否可以综合利用，废液综合利用的程度直接影响到环境的保护。考虑到环保因素，选择适合的培养基，使提取废液的综合利用变得容易，不但可以减轻废物处理的负荷，降低废物处理的运行费用，而且副产品可以产生经济效益，对降低整个生产成本十分有益。

二、发酵培养基设计的基本原则

1.根据生产菌株的营养特性配制培养基

首先要了解生产菌株的生理生化特性和对营养的需求，还要考虑产物的合成途径和产物的化学性质等方面，设计一种既有利于菌体生长又有利于代谢产物合成的培养基。

2.营养成分的配比恰当

无论是菌体生长还是代谢产物形成，营养物质之间都应有合适的配比。浓度太低，则不能满足微生物生长的需要，浓度太高，又会抑制微生物的生长。一般情况下，用于培养菌体的种子培养基营养成分应丰富，尤其是氮源含量宜高，即C/N值低。相反，用于积累大量生产代谢产物的发酵培养基，它的氮源一般应比种子培养基稍低，即C/N值高。当然，若发酵产物是含氮化合物时，有时还应该提高培养基的氮源含量。

在设计培养基时，还应特别考虑到代谢产物是初级代谢产物，还是次级代谢产物。若是次级代谢产物，还要考虑是否加入特殊元素（如维生素B₁₂中的Co）或特定的前体物质（如生产青霉素时，应加入苯乙酸或苯乙酰胺等前体物质）。

在设计培养基尤其是大规模发酵生产用的培养基时，还应重视培养基中各种成分的来源和价格，应该优先选择来源广泛、价格低廉的培养基，提倡“以粗代精”“以废代好”。因此，应针对不同菌株、不同时期的营养需求对培养基的营养物质进行配比。

3.渗透压

对生产菌株来说，培养基中任何营养物质都有一个适合的浓度。从提高发酵罐单位容积的产量来说，应尽可能提高底物浓度，但底物浓度太高，会造成培养基的渗透压太大，从而抑制微生物的生长，反而对产物代谢不利。例如，在谷氨酸发酵中，葡萄糖浓度超过200g/L时，菌体生长明显缓慢。但营养物质浓度太低，有可能不能满足菌体生长、代谢的需求，发酵设备的利用效率不高。为了避免培养基初始渗透压过高，又要获得发酵单位容积内的高产量，目前倾向于采用补料发酵工艺，即培养基底物的初始浓度适中，然后在发酵过程中通过流加高浓度营养物质进行补充。

在设计营养物配比时，还应该考虑避免培养基中各成分之间的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸盐时，会与培养基中的钙离子或镁离子在加热时发生沉淀反应。在高温下，还原糖与蛋白质或氨基酸也会相互作用，产生褐色物质。

4.适宜的pH值

各生产菌株都有其生长最适pH值和产物合成最适pH值，为了满足微生物的生长和代谢的需要，培养基配制和发酵过程中应及时调节pH值，使之处于最适pH值范围。这是因为微生物在生长代谢过程中营养物质的利用和代谢产物的形成往往会改变环境中的pH值。例如，培养基中的蛋白质或氨基酸经发酵后，会产生氨，从而有升高培养基pH值的趋势。培养基的灭菌过程也会引起培养基的pH值发生变化。高温处理过程中，一些大分子发生分解，造成pH值下降。部分微生物生长的最适pH值，见表3-8。

三、发酵培养基设计的方法

培养基的组成必须满足菌体细胞生长繁殖和产物合成代谢的元素需求，要提供维持细胞生命活动和产物合成代谢所需要的能量。在设计各种培养基（种子培养基、发酵培养基）时，要充分考虑细胞的元素组成状况。在实验分析某些细菌细胞的元素组成与培养基中一些元素浓度的相关性时发现，培养基中某些元素如P、K等是超量的，某些元素Zn、Cu等接近最大需求量，P浓度的变化使许多培养液缓冲能力发生变化。细菌、酵母菌和霉菌细胞的元素组成（干重）见表3-9。

对于微生物生长后期能合成某种或某些代谢产物的发酵来说，设计的培养基不仅要考虑细胞组成所需要的元素，而且还要认真分析组成代谢产物的元素种类和数量，同时分析何种营养物质与代谢产物合成有内在联系。一般来说，设计的培养基应具备这样的效果：菌体对数生长期开始时，有生理功能的菌体迅速生长繁殖，对数生长期末能迅速转入代谢产物合成的生产期，并使产物合成速率保持一适宜的线性关系，此种线性关系能维持相当长时间，可获得最大的产物合成量。

确定一种适合于工业生产的孢子培养基、种子培养基、发酵培养基、补料培养基等，仅仅按照微生物细胞营养元素理论值的条件还不能进行培养基的设计，因为微生物的品系不同，其生理特异性差异较大，产物的合成代谢途径比较复杂，所以还必须对微生物种类、生理特性、一般营养需求、产物的组成和生物合成途径、产品的质量要求等进行深入分析。同时，也要考虑所采用的发酵设备和培养条件、原材料的来源等。上述工作完成后才能进行基础培养基组成的设计。设计的基础培养基组成要经过一定时间的摇瓶实验考察，根据菌种的生长动力学、产物合成动力学以及两者的内在联系及其与环境条件的关系，进一步修改其组成，使之适合菌体生长和产物合成的要求。

培养基的基本组成确认后，还要进一步考察所选用的原材料的配比关系，发酵培养基的各种原材料浓度配比恰当，既利于菌体的生长，又能充分发挥菌体合成代谢产物的潜力。如果各种营养物质配比失调，就会影响发酵水平。其中碳源与氮源的比例影响最为显著，碳氮比偏小，能导致菌体的旺盛生长而造成菌体提前衰老自溶，影响产物的积累；碳氮比过大，菌体繁殖数量少，不利于产物的积累；碳氮比合适，而碳源、氮源浓度过高，仍能导致菌体的大量繁殖，增大发酵液黏度，影响溶解氧浓度，容易引起菌体的代谢异样，影响产物合成；碳氮比合适，但碳源、氮源浓度过低，会影响菌体的繁殖，同样不利于产物的积累。因此，发酵培养基中的碳氮比是一个重要的控制指标。另外，生理酸性物质和生理碱性物质的用量也要适当，否则会引起发酵过程中发酵液的pH值大幅度波动，影响菌体生长和产物合成。无机盐的浓度不合适也会影响菌体生长和产物合成。

四、发酵培养基的优化

目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法筛选出较为合适的培养基。在筛选培养基中使用的原材料种类和浓度配比时，经常采用的方法有单因子实验法、正交实验设计、均匀设计和响应面分析等等。

一般培养基设计要经过以下几个步骤：

①根据前人的经验和培养要求，初步确定可能的培养基组分用量。

②通过单因子实验最终确定最为适合的培养基组分。

③当确定培养基成分后，再以统计学方法确定各成分最适合的浓度。

1.单因子实验

单因子实验是传统的有效方法，适用于培养基组成和单一营养成分的选择。在确认培养基基本组成之后，逐个改变某一种营养成分的品种或浓度进行实验，分析比较实验所得的菌种生长情况、碳氮代谢规律、pH值变化情况、产物合成速率等结果，从中确定应采用的原材料品种或配比浓度。单因子实验法在考察较少因素影响时经常被采用，此法消耗大量的人力、物力和时间，其实验结果的准确性不同。

2.正交实验设计

正交实验设计是根据正交性准则来选择有代表性的实验点，这些实验点具备“均匀分散，整齐可比”的特点，有效地解决了实验因素较多而产生的多因素完全实施方案过大的矛盾，具体实验实施时采用规格化的正交表来安排多因素实验，并对实验结果进行统计分析，找出最优实验方案，广泛应用于科学研究和工农业生产中。采用正交实验设计可以达到省时、省力、省钱的效果，同时又能保证得到基本满意的实验结果。

3.均匀设计

均匀设计和正交实验设计相比，只考虑实验点在实验范围内“均匀分散”，而不要求“整齐可比”，也是通过一套精心设计的均匀设计表来进行实验设计。均匀设计实验结果的统计分析一般采用非线性的二次响应曲面回归分析，可考察各因素的重要程度和因素间的交互作用。如果符合线性回归条件，也可采用多重线性回归分析。回归分析，不但可以筛选自变量，还可以根据回归方程找出“最佳组合”，但要注意回归方程的不可外延性。

4.响应面分析

（1）Plackett-Burman（PB）实验设计法是主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著性而采用的实验设计方法，可以分清实验因素对指标影响的大小，找出主要因素，抓住主要矛盾。用此方法可以使实验次数减少，而影响因素的主要效果得到尽可能准确的估计，能从众多的考察因素中尽快而有效地筛选出最为重要的几个因素，以便后面进一步研究。

（2）根据Plackett-Burman（PB）实验设计找出显著因素后，安排最陡爬坡试验，要先逼近最佳区域后再建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳区域。可以了解实验因素与实验指标影响的规律性，即每个因素的水平改变时，指标是怎样变化的。

（3）Box-Benhnken Design（BBD）法是利用合理的实验设计并通过实验得到一定数据，采用多元二次方程来拟合因素和响应面值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优提取条件，解决多变量问题的一种统计学方法。与其他方法相比，BBD实验减少了实验次数，周期短，得到的回归方程精确度高，又能研究好几个因素之间的交互作用，是解决生产过程中实际问题的一种有效办法。