第一节　发酵工业原料

一、发酵工业原料选择的依据

发酵原料的营养成分对微生物的生长、繁殖及代谢的影响极大。微生物生长、繁殖以及代谢的要求不同，其发酵原料成分和含量的要求也存在差异。因此，原料的种类很多，但无论哪种原料，都应满足微生物生长、繁殖和代谢方面所需要的各种营养物质，如碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。从工艺角度来看，凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可作为发酵工业生产的原料。例如选择淀粉质原料生产酒精时，从工艺的角度着眼，任何含有可发酵性糖或可变为发酵性糖的原料，都可作为酒精生产的原料。

对于工业上大规模投入生产的原料，除了要提出工艺上的要求外，还要提出生产管理和经济上的要求，因此，在选择工业上大规模生产酒精的原料时，应考虑下列条件：

（1）因地制宜，就地取材，原料产地离工厂要近，便于运输，节省费用。

（2）营养物质的组成比较丰富，浓度恰当，能满足菌种发育和生长繁殖成大量有生理功能菌丝体的需要，更重要的是能显示出产物合成的潜力。

（3）原料资源要丰富，容易收集。由于酒精生产需要大量原料，要保证一定的库存量。

（4）原料要容易贮藏　应考虑到新鲜原料内含水量多，不耐久藏，最好选择经干燥后含水极少的干原料，易于保藏，不易腐烂。

（5）在一定条件下，所采用的各种成分（生产上常称为原材料）彼此之间不能发生化学反应，理化性质相对稳定。

（6）生产过程中，既不影响通气与搅拌的效果，又不影响产物的分离精制和废物处理。

（7）对人类的身体无损害，影响发酵过程的杂质含量应当极少，或者几乎不含。

（8）原料价格低廉，可降低产品成本。

此外，还应当考虑大力节约粮食原料，尽量少用或不用粮食原料，充分利用当地的非粮食原料，广泛利用野生植物原料，同时利用农林副产物和植物纤维原料，以及亚硫酸盐纸浆废液等，这对于节约粮食原料有着重要意义。

二、培养基的营养成分

工业微生物绝大部分都是异养型微生物，它需要糖类、蛋白质和前体等物质提供能量。

（一）基本营养源

基本营养源主要为微生物提供生长相应的营养条件，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水分等。

1.碳源

凡是能为微生物的生长和代谢提供碳来源的物质统称为碳源。因为微生物细胞的原生质体（细胞内碳架结构）以及几乎所有的代谢产物都是含有碳的有机物质，碳源是微生物细胞壁、荚膜和细胞贮藏物质的主要构成成分，且绝大多数微生物的碳源可以兼作能源。因此，碳源主要用来供给菌种生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的物质基础。

常用的碳源物质有葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及纤维素等。

（1）纯糖原料　葡萄糖是碳源中最易利用的糖，它是由淀粉加工制备的，其产品有固体粉状葡萄糖和葡萄糖浆（含有少量的双糖）。几乎所有微生物都能利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分，广泛运用于抗生素、氨基酸、有机酸、多糖、黄原胶等发酵生产中。但是过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间产物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中（如丙酮酸、乳酸、乙酸等），导致pH值下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。

工业发酵中使用的蔗糖和乳糖既有纯制产品，又有含此两种糖的糖蜜和乳清，麦芽糖多用于制糖浆。它们主要用于抗生素、氨基酸、有机酸、酶类的发酵。

（2）淀粉质原料　淀粉为白色无定形的结晶粉末，存在于各种植物组织中。在显微镜下观察，发现淀粉有圆形、椭圆形和多角形三种形状。淀粉的分子单位是葡萄糖，由许多葡萄糖脱水缩聚而成，其分子式可用（C₆H₁₀O₅）_n表示。淀粉一般有直链淀粉和支链淀粉两种。直链淀粉由不分支的葡萄糖链构成，葡萄糖分子间以α-1，4-糖苷键聚合而成，聚合度一般为100～6000。支链淀粉的直链由葡萄糖分子以α-1，4-糖苷键相连接，而支链与直链葡萄糖分子以α-1，6-糖苷键相连接，它的分子呈树枝状，形成分支结构。支链淀粉分子较大，聚合度为1×10³～3×10⁶，一般在6000以上。

发酵生产的淀粉质原料，一般可分成几类，见表3-1。

（3）糖蜜原料　糖蜜是甘蔗或甜菜糖厂的一种副产物，又称橘水。糖蜜含糖量很高，这些糖分就目前制糖工业技术水平已不能或不宜用结晶方法进行回收。糖蜜是一种非结晶糖分，因其本身就含有相当数量的可发酵性糖，无须糖化。因此，糖蜜是微生物工业大规模发酵生产酒精、甘油、丙酮、丁醇、柠檬酸、谷氨酸、食用酵母及液态饲料等的良好原料。

糖蜜可分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。甘蔗糖蜜是以甘蔗为原料的糖厂的一种副产物。我国南方各省位于亚热带，气候温和，适于种植甘蔗，如广东、广西、福建、四川和台湾等地均盛产甘蔗，甘蔗糖蜜的产量为原料甘蔗的2.5%～3%。甘蔗糖蜜中含有30%～36%的蔗糖与20%的转化糖。甜菜的种植以东北、西北、华北等地区为主，甜菜糖蜜为甜菜糖厂的一种副产物，它的产量为甜菜的3%～4%。 糖蜜中干物质的浓度很大，在80～90°Bx，含50%以上糖分、5%～12%的胶体物质以及10%～12%的灰分，如果不进行预处理，则微生物无法生长和发酵，故糖蜜发酵前的处理非常重要。

（4）纤维素原料　发酵工业是用粮最多的产业部门，每生产1t酒精，耗粮3t左右，每生产1t有机酸，耗粮3～8t，抗生素、酶制剂等用粮量尤其大，全世界微生物工业消耗的粮食原料数量是十分惊人的。随着微生物工业的日益发展，面临着原料供应不足的问题，人们迫切需要开辟新的原料途径，如利用纤维素、石油等。虽然石油代粮发酵研究已取得大量可转化为生产的成果，但是由于石油储量和开采量的限制，特别是石油消耗加速而导致石油价格持续攀升，严重阻碍了石油代粮发酵的产业化步伐。因此，人们不得不重新寻找新的代粮发酵原料。

目前，纤维素成为最现实可行的天然资源。因为它是自然界最丰富的可再生资源，每年通过光合作用合成1×10¹²t以上，这是世界粮食产量的几百倍。所以，开发纤维素代粮发酵的前景广阔，特别是20世纪80年代后，随着各国对环境问题的关注而更倾向于开发利用能够生物降解、环境协调良好且取之不尽、用之不竭的天然原料——纤维素。

纤维素是一种复杂的、天然的高分子多糖化合物，分子结构与淀粉相似，是由D-吡喃葡萄糖环经β-1，4-糖苷键组成的直链多糖，来源于棉花、木材、麻类、草类、某些海洋生物的外壳及各种农产品，其基本的结构单位是纤维二糖。纤维素的分子量可达几十万，甚至几百万，水解纤维素可得到葡萄糖。

木质纤维素的主要来源是农作物秸秆，是世界上最丰富的物质之一，全世界每年秸秆产量约为29亿吨。木质纤维素除纤维素外，还包括半纤维素和木质素。半纤维素是一大类结构不同的多聚糖的统称；木质素是一种高分子芳香族化合物，不能水解成糖，但可用作燃料。

酶解成本较高是纤维素代粮发酵的主要障碍，美国已投入上千万美元进行降低纤维素酶解成本的研究，一旦纤维素酶解成本降低到可经济生产，开发利用纤维素就进入产业化的实质阶段。由于酶解后的单糖非常容易被多种生物利用，所以可进行多种发酵产品的开发应用。

（5）其他碳源　乙醇、甘露醇和甘油可作为微生物的碳源和能源。除乙酸已用作微生物的培养基外，其他有机酸比糖类较难被微生物吸收，作为碳源的效果不如糖类。脂类物质更难被微生物作为碳源利用，但并不是不能利用，低浓度的高级脂肪酸还可刺激某些细菌的生长。少数自养型微生物以CO₂或碳酸盐作为唯一或主要的碳源，因为这两者为碳的最高氧化形式，必须经过预还原才能转化为细胞有机物质的碳架，这个过程需要能量。大多数需要有机碳源的微生物（指异氧型）也需要CO₂，因为有些生物合成反应（如丙酮酸的羧化和脂肪酸的合成）需要CO₂，只是需要量较少而已。虽然这些生物合成反应所需的CO₂可以从有机碳源和能源的代谢中获取，但如果完全排除CO₂，往往会推迟或阻止微生物在有机培养基中的生长。少数细菌和真菌需要环境中含有较多的CO₂（5%～10%）才能在有机培养基中生长。

2.氮源

凡是能为微生物的生长和代谢提供氮来源的物质统称为氮源，氮是组成微生物细胞的第二大要素。氮源主要用来构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质及氨基酸之类的含氮代谢物。一般来说，一个细菌细胞中氮元素的含量约占细胞干重的12%。

发酵工业生产中的氮源有以下几种：

无机氮源：氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠、硝酸铵、磷酸氢二铵等。无机氮源的利用速度一般比有机氮源快，因此无机氮源又被称作速效氮源。

有机氮源：利用缓慢，包括蛋白胨、牛肉膏、花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、酵母粉、麸皮水解液、鱼粉、蚕蛹粉、发酵菌丝体和酒糟等。工业上常用的有机氮源及含氮量见表3-2。

（1）玉米浆　是一种用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水浓缩物，含丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，它的平均化学组成见表3-3。

（2）黄豆饼粉　水分11%，总氮11.2%，类脂物0.6%，总糖30%，灰分6.5%。

（3）麸皮水解液　可以代替玉米浆，但蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。

（4）尿素　菌体必须含脲酶方可使用。

（5）氨水　是一种无机氮源，目前常在生产中使用高浓度液氨，因分解，容易带来pH波动的问题。

天然原料中的有机氮源由于产地不同，加工方法不同，其质量不稳定，常引起发酵水平波动。因此，在选择有机氮源时要注意品种、产地、加工方法、贮藏条件对发酵的影响。凡能利用无机氮源的微生物，一般也能利用有机氮源，但有些微生物在只含无机氮源的培养基中不能繁殖，因为它们没有将无机氮化合物转化为有机氮化合物的能力。在发酵工业上，常常需要注意氮源与菌体生长和代谢产物合成的相关性。

3.无机盐

无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质，其主要功能是构成菌体的成分，作为酶的组成部分或维持酶的活性，调节渗透压、pH 值、氧化还原电位等。无机盐类中的元素可分为主要元素和微量元素两大类，主要元素有P、S、Mg、K、Ca等，微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn等。在制备培养基时，通常加入K₂HPO₄（或KH₂PO₄）、MgSO₄就可满足制备条件，但是菌种不同，需要的各种无机盐类和微量元素的浓度也不同，必须根据具体情况予以控制。

4.生长因子

生长因子一般指微生物生长所不可缺少的，能调节微生物的代谢活动，不能从一般的碳源和氮源物质合成，必须另外添加的微量有机物，一般指B族维生素，也有氨基酸、嘌呤和嘧啶。

在微生物的科研和生产中，酵母膏、玉米浆、肝脏浸出液等，通常被作为生长因子的来源物质。事实上，许多作为碳源和氮源的天然成分，如麦芽汁、牛肉膏、麸皮、米糠、土豆汁等本身就含有极为丰富的生长因子，一般在这类培养基中，无须再另外添加生长因子。

5.水分

水既是微生物细胞的重要组成成分，占细胞总量的80%～90%，又是微生物体内和体外的溶剂，营养物质只有溶解于水才能被细胞吸收；同时，一定量的水分是维持细胞渗透压的必要条件，代谢产物也只有通过水才能排出菌体外。由于水的比热容高，因此水又是热的良导体，能够有效调节细胞的温度。

（二）前体、促进剂和抑制剂

发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，并不促进微生物的生长，这些添加的物质包括前体、抑制剂和促进剂（包括诱导剂、生长因子）等。

1.前体

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子上，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。前体最早是从青霉素的生产中发现的，在青霉素生产中，人们发现加入玉米浆后，青霉素产量可大大提高，进一步研究后发现发酵单位增长的主要原因是玉米浆中含有苯乙胺，它被优先结合到青霉素分子中去，从而提高了青霉素的产量。

2.促进剂和抑制剂

促进剂和抑制剂是指通过促进或抑制某一反应的发生来调节微生物的代谢，使生化反应集中在目标产物的形成上，从而提高产品的产量和质量的物质，前者称为促进剂，后者称为抑制剂。例如加巴比妥盐能使利福霉素的发酵单位增加等。

在发酵过程中除了要加入上述物质外，有时还要加入消泡剂、表面活性剂等物质，以提高发酵罐的装料量和使产物析出。

三、常用发酵原料的化学组成

发酵原料所含的化学成分，不仅关系着生产率的高低，同时也影响生产的工艺过程。常用原料中主要的化学成分见表3-4～表3-6。

1.糖类

原料中所含的淀粉，或与淀粉类似的菊糖、蔗糖、麦芽糖、果糖及葡萄糖等，都可以发酵生成产品，同时也是霉菌和酵母的营养及能源，原料中含这些物质越多，生成的酒精也就越多，所以它和产量有着密切的关系。糖类中的五碳糖多存在于原料的皮层，如麸皮、高粱糠、谷糠、花生壳等，它不但影响淀粉含量，发酵中也易生成有害的糠醛。纤维素虽属于糖类，但不被淀粉水解，只起填充作用，对于发酵没有直接影响。

2.蛋白质

原料含有的蛋白质，在发酵生产过程中，经蛋白酶水解后，可作为微生物生长繁殖的重要营养成分，而微生物细胞中，30%～50%（干重）是蛋白质。一般来说，当培养基内氮的含量适当，则微生物生长旺盛，酶的含量也较高。有些原料所含蛋白质有时不能满足微生物生长和繁殖的要求，则应从外界加入氮源。氮源一般包括有机氮源和无机氮源两种，根据不同情况，添加不同种类的氮源。

3.脂肪

脂肪对发酵有影响，如高粱糠、米糠等含油脂多，则产酸较快，产酸幅度也较大。一些发酵工厂如采用玉米作为原料，需要把玉米胚芽除去。

4.灰分

灰分中的磷、硫、镁、钾、钙等是构成菌体细胞和辅酶的重要成分。另外，灰分还有调节培养基渗透压的作用，是微生物生长不可缺少的。在一般原料中，灰分的含量通常足够。

四、培养基的类型

在微生物发酵工业中，培养基是决定发酵生产效率的关键因素之一，培养基的成分和配比合适与否对生长菌的生长繁殖、代谢产物的发酵提取工艺及最终产品的产量和质量都产生相当大的影响。良好的培养基能充分发挥生产菌种的生物合成能力，与有效的培养条件相配合就可达到最大的生产效率。因此，在发酵工业中，培养基的组成是决定生产成本的关键因素，合理配比对发酵生产具有重要意义。

1.根据营养物质的不同来源

（1）天然培养基　是用各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质（如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、米曲汁、蛋白胨等）以及天然的含有丰富营养的有机物质（如马铃薯、玉米粉、麸皮、花生饼粉等）制成的培养基。天然培养基在发酵工业中普遍使用，优点是配制方便、经济、营养丰富，适合于微生物生长。但是，它的化学成分不清楚或不稳定（受产地、品种、保存加工方法等因素影响）。

（2）合成培养基　使用成分完全了解的化学药品配制而成的培养基称为合成培养基。合成培养基的特点是化学成分明确、稳定，重复性好，但价格较贵，培养的微生物生长较慢。合成培养基适用于实验室进行微生物生理、遗传育种及高产菌种性能的研究；在生产某些疫苗过程中，为防止异性蛋白等杂质混入，也经常使用。培养放线菌的高氏一号培养基和培养真菌的察氏培养基都属于合成培养基。

（3）半合成培养基　以天然的有机物作为碳源、氮源及生长因子的来源，并适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需求。例如，培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基等。此类培养基的特点是配制方便、成本低、微生物生长良好、应用很广，大多数微生物都能在此类培养基上生长。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。

2.根据培养基的用途

（1）基础培养基　基础培养基又称最低限度培养基，指能满足某菌种的野生型（原养型）菌株最低营养要求的合成培养基。不同微生物的基础培养基不相同，有的极为简单，如大肠杆菌的基本培养基；有的极为复杂，如一些乳酸菌、酵母菌或梭菌的基本培养基。基本培养基有时也需要添加生长因子等。

若在基础培养基中加入富含氨基酸、维生素、碱基等生长因子的营养物质，如蛋白胨、酵母膏等，就可满足各种营养缺陷型菌株的生长需求，这种培养基称为完全培养基。若在基础培养基中只是针对性地加入一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长，那么，这种培养基称为补充培养基。

（2）增殖培养基　增殖培养基又名富集培养基。富集培养基是在普通培养基中加入血液、动（植）物组织液或其他营养物（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。它主要用于培养某种或某类营养要求苛刻的异养型微生物，或者用来选择性培养（分离、筛选、富集）某种微生物。增殖培养基具有助长某种微生物的生长，抑制其他微生物生长的功能。广义上讲，保藏培养基和鉴别培养基也属于富集培养基。

（3）鉴别培养基　在培养基中添加某种或某些化学试剂后，某种微生物生长过程中产生的特殊代谢产物会与加入的这些化学试剂反应，依靠指示剂的显色反应，借以鉴别不同种类的微生物。这种培养基称为鉴别培养基。

例如：检测饮用水、乳品中是否含肠道致病菌的伊红-美蓝乳糖培养基，即EMB（eosin methylene blue）培养基。其成分是：蛋白胨10g，乳糖10g，K₂HPO₄ 2g，2%伊红20mL，0.325%美蓝20mL，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

其中的伊红和美蓝两种苯胺染料可以抑制革兰氏阳性菌和一些难培养的革兰氏阴性菌。试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨认。尤其是大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量混合酸，使菌体带H⁺，很容易染上酸性染料伊红，伊红又与美蓝结合，其复合物为黑色，所以，大肠杆菌的菌落呈紫黑色并带金属光泽，其菌落较小。产气杆菌产生少量酸，菌落呈棕色；变形杆菌不能发酵乳糖，菌落无色、透明。

（4）选择培养基　根据某种或某类微生物的特殊营养要求，或对某些物理、化学条件的抗性而设计的培养基，称为选择培养基。利用这种培养基可以把某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。常用抑菌剂或杀菌剂（如染色剂、抗生素等）来抑制不需要的菌的生长，而促进某种需要的菌的生长。

3.根据培养基的物理形状

（1）液体培养基　各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基称为液体培养基。工业上绝大多数发酵都采用液体培养基。实验室中微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体也常利用液体培养基。

（2）固体培养基　在液体培养基中加入一定量的凝固剂（如琼脂、明胶等）配制而成的固体状态的培养基。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如它可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获取孢子等。在发酵工业常用固体培养基进行固体发酵。

琼脂是最好的凝固剂。它是从海藻中提取的多糖类物质，主要由琼脂糖和琼脂胶两种多糖组成。除极少数菌外，大多数微生物无法降解琼脂。琼脂在45℃固化，约100℃才熔化，灭菌过程中不会被破坏，并且价格低廉。培养基中加0.5%琼脂可以获得半固体培养基，加入1.5%～2.0%琼脂即获得固体培养基，加8%琼脂则获得硬固体培养基。

明胶也是一种凝固剂。它是由动物的皮、骨、韧带等煮熬而成的一种蛋白质，含有多种氨基酸，可作为许多微生物的氮源。明胶在20℃凝固，28～35℃熔化，所以，只能在20～25℃温度范围作凝固剂使用，适用面很窄，但可用于特殊检验。

硅胶是硅酸钠（Na₂SiO₃）和硅酸钾（K₂SiO₃）与盐酸和硫酸中和反应时凝结成的胶体。因为它属于完全的无机物质，在研究分离自养菌时用作培养基的凝固剂。硅胶一旦凝固后，就无法再熔化。

（3）半固体培养基　半固体培养基是指琼脂加入量为0.2%～0.5%而配制的固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。

4.根据培养基在发酵生产中的应用

（1）繁殖和保藏培养基　主要用于微生物细胞生长、繁殖和保藏，大部分情况下是斜面培养基，包括细菌、酵母菌等的斜面培养基以及霉菌、放线菌产孢子培养基或麸曲培养基等。此类培养基的特点是：①富含有机氮源，少含碳源；②所用无机盐的浓度要适量；③pH值和湿度要适中。

（2）种子培养基　种子培养基是适合微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多、强壮而整齐的种子细胞。种子培养基的一般要求：①氮源、维生素丰富，氮源含量高些，总浓度稀薄；②少量碳源，若糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使pH值下降，菌种容易衰老；③种子培养基成分应与发酵培养基的主要成分相近，以缩短发酵阶段的适应期（延滞期）。谷氨酸发酵不同培养基的组成，见表3-7。

（3）发酵培养基　用于生产预定发酵产物的培养基。因此必须根据产物合成的特点来设计培养基。一般的发酵产物以碳为主要元素，所以，发酵培养基中的碳源含量往往高于种子培养基。若产物的含氮量高，应增加氮源。在大规模生产时，原料应该价廉易得，还应有利于下游的分离提取工作。