3.2　光度法的误差

3.2.1　偏离Beer定律的因素

根据上述Beer定律，当波长和入射光强度一定时，吸光度A与吸光物质的浓度c应成正比，即A-c曲线应为一条通过原点的直线。但在实际工作中，特别是当溶液浓度较高时，A-c曲线常会出现偏离直线的情况（图3-6），即发生偏离Beer定律的现象。若所测试的溶液浓度在标准曲线的弯曲部分，必将产生较大的误差。偏离Beer定律的因素主要有化学因素与光学因素。

（1）化学因素

Beer定律成立的前提通常应是稀溶液，随着溶液浓度的改变，溶液中的吸光物质可因浓度的改变而发生离解、缔合、溶剂化以及配合物生成等变化，使吸光物质的存在形式发生变化，影响物质对光的吸收能力，因而偏离Beer定律。

如重铬酸钾的水溶液中存在以下平衡：，若将溶液严格地稀释2倍，则溶液中Cr2的浓度不是恰好减少为原来的一半，而是受稀释平衡向右移动的影响，Cr2浓度的减少多于原来的一半，结果导致偏离Beer定律而产生误差。不过若在强酸性溶液中测定Cr2或在强碱性溶液中测定Cr，则可避免上述偏离现象。由化学因素引起的偏离，有时可通过控制实验条件加以避免。

（2）光学因素

①非单色光　由Beer定律的物理意义可知，Beer定律只适用于单色光。但事实上真正的单色光是难以得到的，实际应用中采用的光包含了所需波长的光和附近波长的光，即为具有一定波长范围的光。这一宽度称为谱带宽度，常用半峰宽表示，即最大透光度一半处曲线的宽度（图3-7）。实际应用于测量的都是具有一定谱带宽度的复合光，因吸光物质对不同波长的光的吸收能力不同，遂导致了对Beer定律的偏离。

例如，按图3-8所示的吸收光谱，用谱带a所对应的波长进行测定，A随波长的变化不大，引起的偏离就比较小。用谱带b对应的波长进行测定，A随波长的变化较明显，就会产生较大的偏离。所以为了减小因非单色光所带来的误差，通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长，同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。这样既可以保证对Beer定律的偏离较小，又能保证测定有较高的灵敏度。

②杂散光　 从单色器得到的单色光中，还有一些不在谱带范围内的与所需波长相隔甚远的光，称为杂散光。它是因仪器光学系统的缺陷或光学元件受灰尘、霉蚀的影响而引起的，特别是在透光率很弱的情况下，会产生明显的干扰作用。设入射光的强度为I0、透过光的强度为It、杂散光强度为Is，则观测到的吸光度为：

A=lg　　 （3-8）

若样品不吸收杂散光，则（I0+Is）/（It+Is）<I0/It，使A变小，产生负偏离。这种情况是分析中经常遇到的。随着仪器制造工艺的提高，绝大部分波长内杂散光的影响可忽略不计，但在接近紫外末端处，杂散光的比例相对增大，干扰增强，甚至还会出现假峰。

③散射光和反射光　入射光通过吸收池内外界面之间时，界面产生反射作用，同时吸光质点对入射光又有散射作用。散射光和反射光均由入射光谱带宽度内的光产生，对透射光强度有直接影响，均导致透射光强度减弱。真溶液散射作用较弱，可用空白溶液进行补偿。浑浊溶液散射作用较强，一般不易制备相同的空白溶液，常使测得的吸光度产生偏离。

④非平行光　 Beer定律适用的另一个条件是平行光，但在实际检测中，通过吸收池的光，通常都不是真正的平行光。倾斜光通过吸收池的实际光程将比垂直照射的平行光的光程长，使吸光度增加。这也是同一物质用不同仪器测定吸收系数时，产生差异的主要原因之一。

3.2.2　测量误差

任何分光光度计都有一定的测量误差，这是由于光源不稳定、读数不准确等因素造成的。一般来说，透射比读数误差ΔT是一个常数，但在不同的读数范围内所引起的浓度的相对误差却是不同的，浓度测定结果的相对误差与透光率测量误差间的关系可由定律导出：

c==-

微分后并除以上式，可得浓度的相对误差Δc/c为：

=　　 （3-9）

式（3-9）表明，浓度测量的相对误差，取决于透光率T和透光率测量误差ΔT的大小。上式表明，浓度测量的相对误差，不但与分光光度计的读数误差ΔT有关，而且与透光率T也有关。ΔT由分光光度计透光率读数精度所确定，以仪器的读数误差ΔT代入式（3-9），计算不同透光率或吸光度时的浓度相对误差列于表3-2。

若以浓度相对误差对T作图可得到如图3-9所示的函数曲线。从图3-9中可见，溶液的透光率很大或很小时所产生的相对误差都很大。只有中间一段即T值在65%～20%或A值在0.2～0.7之间时，浓度相对误差较小，是测量的适宜范围。将式（3-9）求极值可得到浓度相对误差最小时的透光率或吸光度，即A=0.434，T=36.8%。但在实际工作中没有必要去寻求这一最小误差点，只要求测量的吸光度A在0.2～0.7适宜范围内即可。

3.2.3　测量条件的选择

（1）入射光波长的选择

入射光波长选择的依据是吸收曲线，一般以最大吸收波长λmax为测量的入射光波长。若被测物质存在干扰，且干扰物在λmax处也有吸收，则根据“吸收最大，干扰最小”的原则，在干扰最小的条件下选择吸光度最大的波长。例如：KMnO4的测定一般选择λmax=525nm，此时灵敏度最高。但若在K2Cr2O7存在下测量KMnO4时，则不选择λmax =525nm，而是选择另一最大吸收波长λ=545nm，因为此波长处K2Cr2O7不干扰KMnO4溶液吸光度的测定。

（2）吸光度范围的选择

当溶液的吸光度不在0.2～0.7范围内时，可以通过改变称样量、稀释溶液以及选择不同厚度的比色皿来控制吸光度。

（3）参比溶液的选择

选择参比溶液的总原则是使试样的吸光度能真正反映待测物的浓度。通常利用空白试验来消除因溶剂或器皿对入射光反射和吸收带来的误差。参比溶液的选择方法如下：

①纯溶剂空白　在测定入射光波长下，溶液中只有被测组分对光有吸收，而显色剂或其他组分对光没有吸收，或虽有少许吸收，但所引起的测定误差在允许范围内，在此种情况下可用溶剂作为空白溶液。

②试剂空白　试剂空白是指在相同条件下只是不加试样溶液，而依次加入各种试剂和溶剂所得到的空白溶液。试剂空白适用于在测定条件下，显色剂或其他试剂、溶剂等对待测组分的测定有干扰的情况。

③试样空白　试样空白是指在与显色反应同样条件下取同样量试样溶液，只是不加显色剂所制备的空白溶液。试样空白适用于试样基体有色并在测定条件下有吸收，而显色剂溶液不干扰测定，也不与试样基体显色的情况。