第三章 男子不育诊断技术

第一节 精液检查

精液主要由精子和精浆组成，精子由睾丸生精细胞衍化产生，在附睾发育成熟，由输精管输出。精浆是男性附属性腺（附睾、精囊、前列腺、尿道球腺和尿道旁腺）分泌的混合液，含有蛋白、凝固酶、水解酶、果糖、无机盐等维持精子生命活动所需的物质，是营养精子、激发精子活力的重要物质和输送精子的载体，对精子成熟、运动及受精产生重要作用。精液检查主要内容包括精液常规检查、精子功能检查、精液非精子细胞检查、精液生化测定、微量元素测定，以及计算机辅助精液分析等。

一、精液常规检查

（一）精液标本采集与运送

1．采集要求 采集标本前应禁欲5～7d，禁欲时间过短或过长会影响精液检查结果。重复检查一般间隔1～2周，复查2～3次。采集时将一次射出的精液全部排入洁净、干燥的容器内。精液微生物检查应使用无菌容器。采集完毕，在容器上注明姓名、识别号、采集日期和时间。

2．采集方法 主要有手淫法、电动按摩刺激法、性交体外排精法等。手淫法是标准的采集方法。手淫法不能取出精液者，可用电动按摩器取精。两种方法均不成功时，可采用性交体外排精法，此法可能会丢失精子密度最高的前段精液，影响精液检查的准确性。不能用避孕套法收集精液。

3．标本运送 精液采集后立即送检，在检查处外的地方采集的标本应在30min内送至检查处，最迟不要超过1h。标本运送应保存在20～40℃环境，温度过高或过低都会影响精子活力（率）。

（二）精液肉眼检查

1．精液外观 正常精液呈灰白色、灰黄色或乳白色胶状体，有一定的黏度。禁欲时间长短影响精液外观，久未射精的精液呈淡黄色。精液自行液化后呈乳白色或灰黄色半透明状。精子数量较少时精液较透明而稀薄，无精子症精液为白或黄色清亮的液体；鲜红色、暗红色血性精液，见于生殖系统炎症、结核或肿瘤；黄色、棕色脓样精液，见于精囊炎或前列腺炎。某些药物可使精液染成特殊颜色。精液有一种特殊腥味，由前列腺分泌的精胺发生氧化而致。

2．精液量 用刻度量筒或移液管测定。正常一次全部射精精液量约2～6ml，平均3.5ml。精液排出量与排精间隔时间长短有关，出现异常时应间隔1周后再复查。精液量过多（＞8ml）可能是附属性腺功能亢进，或垂体促性腺激素分泌亢进，使雄激素水平升高所致，也可见于禁欲时间过长者。精液量过多可造成精子密度偏低，或精液过多使阴道内精液大量流出并带出大量的精子，导致不育。禁欲5～7d，精液量＜1.5ml为精液过少，可能是逆行射精、睾丸分泌雄激素低下、副性腺功能障碍（如精囊腺和前列腺病变）或收集方式不当等造成。精液量数滴甚至无精液排出者为无精症，常见于生殖系统结核、非特异性炎症、睾丸发育不良等。

3．精液液化 精液液化时间是指新排出的精液从胶冻状转变为自由流动状态所需的时间。一般精液离体后5～10min开始液化，20～40min可完全液化。在室温下，正常精液排出后60min精液仍未液化，称为精液迟缓液化症或精液不液化症。前列腺分泌精液液化因子，精液液化时间异常，室温下1h不液化，提示前列腺功能低下，常见于前列腺分泌的蛋白水解酶缺乏，影响精子活力，可导致不育。精囊腺分泌精液凝固蛋白，如果刚射出的精液不凝固或者黏稠度过低，多见于射精管缺陷或先天性精囊缺如。

4．精液黏稠度 精液黏稠度异常可影响精子活力和精子穿透能力。精液黏稠度检测应在精液完全液化后进行。吸管法：用一宽孔的5ml滴管轻轻吸入精液，然后让精液在重力作用下滴落并观察其拉丝长度，正常精液在吸管口呈不连续的小液滴。黏稠度异常的精液，液滴可形成＞2cm的拉丝。直接玻棒法：用一细玻璃棒插入精液中，然后用玻璃棒挑起精液，观察其拉丝长度，正常不应＞2cm。还有黏度计法。精液黏稠度过高或过低均反应精液质量不佳。精液稀薄，黏稠度下降，可见于精子浓度太低或无精子症。黏液黏度还与吸烟程度及前列腺炎有关。

5．pH值 正常精液呈弱碱性，pH值7.2～8.0，可中和阴道分泌物中的有机酸，利于精子游动。如精液量少，不能中和阴道中的酸，不利于保护精子活力，影响精子穿透宫颈管，对受孕不利。pH＜7.0，常见于输精管阻塞、先天性无精囊及附睾病变如慢性炎症；pH＞8.0，常见于附属性腺或附睾炎症及前列腺液缺乏，如前列腺炎、精囊炎、尿道炎及附睾急性炎症。

（三）精液显微检查

1．标本制备 精液完全液化并充分混匀后，取1小滴精液标本置于载玻片上，加上盖玻片，用低倍光学显微镜观察标本内有无精子成分，若标本中未见精子成分，则应将精液标本离心后再检查。一般使用3000r/min，离心15min后再行观察。

2．精子密度 指每毫升精液中的精子数目，也称精子计数或精子浓度。精子密度与精液量乘积即为精子总数。正常人精子有较高的密度、活动度及精液有较强的黏稠性，计数前应适当稀释，杀死或抑制精子活动，降低精液黏稠性，以便计数。可使用标准血细胞计数器来检验。将精液标本充分混匀，按1∶20比例稀释后，滴入血细胞计数盘内，室温静置2～5min，精子完全沉积后，高倍镜计数中央大方格内5个中方格的精子数。5个中方格精子数乘以106，即为每毫升精液精子数。现常用Makler精子计数板、Microcell精子计数池、计算机辅助精液分析（CASA）、精子质量分析仪（SQA）及精子图像分析仪等检测。

正常人精液精子密度变化很大，精子密度为（60～150）×106/ml, WHO规定精子致孕密度低限为20×106/ml。连续3次检查皆低下者可确定为少精子症，精液中多次未查到精子为无精子症，主要见于睾丸生精功能低下，先天性输精管、精囊缺陷或输精管阻塞等，精索静脉曲张、铅等重金属有害物质污染、大剂量放射线及某些药物，也可引起精子减少。正常人从50岁开始精子数逐渐减少。

3．精子活力 指活动精子的运动能力。精子活力受许多因素影响，如精液离体时间、检查室温度、精液液化程度等。精子活力检查最好在排精后30～60min内完成，并控制好室温（18～24℃）。检测用的精液量及盖玻片大小应当标准化，以保证分析时精液量的一致性。盖玻片至玻片的高度应当使精子具有可充分旋转运动的空间。

（1）检测方法。从完全液化并充分混匀的精液标本中取10μl滴于干净载玻片或精液分析计数板上，盖上盖玻片，室温静置lmin，在低倍显微镜下随机选择10个视野，观察精子活动状态，至少计数200个精子，按活力分级标准记录各级精子的百分率。

（2）活力分级。WHO分级方法将精子活力分为4级，即a级：快速直线前向运动，b级：慢速或无定向前向运动，c级：非前向运动，d级：不运动。

（3）活力判断。根据WHO标准，正常精子活力为：a级精子＞25%，或a +b级精子＞50%。

（4）临床意义。精子活力是精子质量重要参数，与受精能力十分密切。精子活力低下，难以抵达输卵管或不能与卵子结合而不能完成受精过程。a级活力精子量不足会影响受精率。连续检查精子存活率不足40%，且以c级活动力精子为主，则可能为男性不育原因之一。精子活动力下降，见于精索静脉曲张、生殖系非特异性感染，以及使用某些抗代谢药、抗疟药、雌激素、氧化氮芥等。

4．精子存活率 指精子总数中活精子所占比例。不动精子并不都是死精子，可采用精子体外活体染色技术定量测定精子活率。死精子头部膜受损，染色液可渗透到细胞内而使细胞着色，反之活精子不着色。死、活精子对同一种荧光染料发不同的荧光。

（1）检测方法。有伊红Y法、伊红苯胺黑法、台盼蓝法和吖啶橙荧光染色法（本书介绍前3法）。①伊红Y染色：取1滴液化混匀的精液与1滴0.5%伊红Y溶液混匀，置于载玻片上，1～2min后制成涂片，自然干燥后高倍普通光学显微镜下观察。活精子不着色，死精子着红色。②伊红苯胺黑染色：取1滴液化混匀的精液与1滴1%伊红Y溶液混匀，30s后再取10%苯胺黑溶液3滴与其混匀，取1滴混合液置载玻片上，制成涂片，自然干燥后显微镜下观察，活精子不着色，死精子着红色，背景为黑色。③台盼蓝染色：取1滴液化混匀的精液与1滴2%台盼蓝溶液混匀，置于载玻片上，1～2min后制成涂片，自然干燥后显微镜下观察，活精子不着色，死精子着蓝色。

（2）结果判断。高倍镜观察计数200个精子，统计活精子和死精子数量。精子存活率一般射精后1h应≥75%,3h应≥40%～50%,6h应≥20%～30%。

（3）临床意义。精子存活率可作为评估精子活力分组准确性的指标。精子存活率低，可能与附睾功能障碍、生殖道炎症、局部温度及环境污染有关。

5．精子凝集 活动精子粘附在一起，可有头对头、尾对尾、头对尾、体部与体部或尾与体部粘附等。检查时将1滴液化混匀的精液置于载玻片上，加上盖玻片，在高倍镜下观察5～10个视野中有无活动精子粘附现象、粘附方式以及粘附精子与非粘附精子大致比例。但活动精子与精液中黏液丝或其他细胞成分及细胞碎片等粘附不能视为凝集。正常人精子无凝集或凝集率＜10%。精子凝集提示可能存在生殖道炎症或免疫因素等。

6．精子形态 精子形态检查方法有两种：一是制成新鲜湿片，普通显微镜和相差显微镜观察；二是将精子固定、染色后用亮视野光学显微镜观察。精子染色可用吉姆萨（Giemsa）、改良巴氏（Papanicolaon）、勃利氏（Bryan-leishman）或肖尔（Shorr）染色法，常用巴氏染色法。

正常精子形态：头部椭圆形，长4.0～5.5μm，宽2.5～3.0μm，长宽比值1.5～1.75，顶体区占头部40%～70%；颈、中段或尾部无缺陷；细胞质微粒不大于正常头部1/3。将所有处于边缘异常状态的精子均列为不正常。

畸形精子形态：可见精子头部、颈和中段、尾部畸形及混合畸形。①头部畸形：如长头、大头、小头、尖头、圆头、锥形头、梨形头、蘑菇样头、无定形头、空泡样头、双头等。头部顶体异常有顶体完全缺失（如锅铲形精子和圆头精子）、顶体部分缺失（如小头畸形精子和小尖头畸形精子）、顶体结构异常（形式众多，泡状顶体较常见）和顶体数量异常（包括顶体数量增多和减少）。②颈和中段畸形，如中段过粗或不规则或弯曲、中段过细（即无线粒体鞘）、双体、颈部弯曲等。③尾部畸形，如无尾、双尾或多尾、分叉尾、短尾、尾部过宽、卷尾、尾部弯曲（＞90°）、楔形尾、三角形尾、宽度不规则、尾部伴有末端微滴或以上缺陷联合体。④混合畸形，同一精子有2种或2种以上畸形。⑤含原生质（胞浆小滴）异常精子：胞浆小滴是精子细胞的残余体，其小滴至少有头部一半大小，与头部中段或尾部上段相连。多种缺陷同时存在只记录一种，优先记录头部缺陷，其次中段缺陷，最后尾部缺陷。每种精子缺陷的平均数目称为畸形精子指数，是预测精子在体内、体外功能的指标。形态学分析应分别记录每种缺陷。

生理情况下精子形态有许多变异，这给精子形态评估带来麻烦。正常精液中正常形态精子应≥30%，精液中畸形精子增多，大于70%称畸形精子症。不得以某次结果确诊，而应重复检查3次以上，两次复查间隔以禁欲5～7d为宜。应注意与精子抗原抗体凝集反应相区别。畸形精子范围很大，WHO提示，若形态正常的精子低于15%则体外受精能力下降。畸形精子增多与睾丸、附睾功能异常密切相关，生殖系感染、精索静脉曲张、雄性激素水平异常、某些化学药物（如硝基呋喃妥因）以及遗传因素均可影响睾丸生精功能，导致畸形精子增多。

7．非精子成分 见本节“精液非精子细胞检查”。

（四）精液分析正常参考值

精液分析参数值是判断男性生育能力的重要指标，各项参数值变化较大，不同个体或同一个体不同阶段可能出现较大变化，其结果一般仅提供生育或不育的倾向。目前精液分析采用的正常值是基于对许多有正常生育能力的男性群体检测后所得的统计结果。

（五）计算机辅助精液分析

计算机辅助精液分析（CASA）是用高分辨率摄像机，实时记录精子及精子运动图像，用计算机对图像进行处理与分析，对精子计数、精子运动速度、方式和精子形态学参数进行自动定量测定。CASA系统辅助精液分析主要参数有：

1．运动精子密度 每毫升精液样本中运动速度VAP＞0μm/s的精子数。①前向运动精子密度：每毫升样本中运动速度＞25μm/s、直线性＞80%的精子数。②活动率：样本中运动精子占精子总数的百分率。③前向运动率：样本中前向运动精子占精子总数的百分率。

2．精子活力参数 ①精子平均运动路径速度（VAP）：精子头沿其行走轨迹的平均路径速度，计算机将精子运动的实际轨迹平均后计算出来。②精子运动速度分布：快速（4）VAP≥25μm/s；中速（3）10μm/s≤VAP＜25μm/s；慢速（2）0＜VAP＜10μm/s；静止（0～1）VAP=0。③轨迹速度（VCL）：也称曲线速度，精子头部沿其实际行走轨迹的运动速度。④直线运动速度（VSL）：即前向运动速度，精子头部直线移动距离（起点与终点间）速度。⑤摆动频率（BCF）：精子头部跨越精子运动路径的频率。

3．精子运动方向参数 ①线性度（LIN）:VSL/VCL，测量精子运动轨迹的直线分离度。②直线性（STR）:VSL/VAP，测量精子运动路径的直线分离度。③头部侧置幅度（ALH）：以精子运动路径为基础的精子头部侧置量，可以是平均值，也可以是最大值，不同型号CASA系统计算方法不一。④摆动性（WOB），也称摆动频率，即精子头部跨越其平均路径的频率。⑤平均移动角度（MAD）：精子头部沿其运动轨迹瞬间转折角度的平均值。

二、精子功能检查

精子功能检查是精液常规检查的必要补充，包括精卵相互作用试验、精子-宫颈黏液相互作用试验、精子膜功能试验、精子核功能试验、精子顶体反应与顶体酶活力测定以及精子线粒体功能测定等。

（一）精卵相互作用试验

精卵相互作用试验包括精子穿卵试验、精子-透明带附着试验。

1．精子穿卵试验 目前尚无一种准确预见精子受精能力的方法，应用最广的是精子穿去透明带仓鼠卵试验（简称精子穿卵试验，SPA），可测定人精子获能、顶体反应和对卵细胞的穿透能力，综合反映精子的受精能力。精子穿卵试验结果与精液常规参数相关，结果不良则自然妊娠率差，体外受精成功率低。SPA有助于了解精子功能，选择治疗方案，结果良好可作IUI，结果不佳则行ICSI。

（1）试验方法。①试剂。BWW储存液：NaCl 5.54g, KCl 0.356g, CaCl·2H2O 0.25g, K2HPO40.162g, MgSO4·7H2O 0.294g, NaHCO32.1g，酚红溶液1ml，加蒸馏水至1000ml。BWW培养液：乳酸钠糖浆0.37ml（600g/L），焦丙酮酸钠0.003g，葡萄糖0.1g，青、链霉素各105U/ml，人血清白蛋白0.35g, Hepes缓冲液2ml（20mmol/ml Hepes盐），加BWW培养液100ml，通入二氧化碳气体调pH至7.4。BWW获能液：人血清白蛋白0.15g加至BWW培养液100ml内。玻璃酸酶液与胰蛋白酶液：浓度均为0.1g/100ml，临用前BWW培养液配制。②精子标本制备：禁欲24h取精，30min内送检，精液置入锥形离心管，加BWW培养液至10ml, 600g离心5min，去上清，洗涤3次，加BWW获能液，置5%二氧化碳培养箱37℃培养1h，或试管密封普通培养箱37℃孵育。500g离心5min，去上清，用BWW获能液调整精子为10×106/ml，重悬至少0.5ml培养液中，试管倾斜与水平呈20°。5%二氧化碳培养箱37℃培养18～24h，或试管密封普通培养箱37℃孵育。③去透明带仓鼠卵制备：8～12周龄仓鼠观察2个性周期，阴道口出现白色分泌物为周期第1天，上午鼠腹注射孕马血清和HCG各30～40U，第3天下午（约56h）再注射HCG 50U,18h后处死剖腹，取出卵巢，浸泡BWW培养液的培养皿中，立体显微镜下从伞部插入针头，刺破卵泡，冲洗卵泡腔，冲洗液中含成熟卵，一般可获30～50个。将卵放入玻璃酸酶液，待大部分卵丘细胞散脱后用BWW液洗1次。用胰蛋白酶液去透明带，用BWW液洗2次，分离出卵母细胞，立即移至精子悬液中，或4℃储存至多24h。④试验：将孵育管垂置20min，抽吸上清液中活动精子并将浓度调为3.5×106/ml。将每滴50～100μl精子悬液微滴置于液状石蜡之下，加入去透明带鼠卵30个，使每个小滴至少渗入15个卵。5%二氧化碳培养箱37℃培养3h后观察。吸出卵子以BWW培养液洗3次，去除吸附于卵子表面的精子。受精卵置载玻片上，周围涂少许凡士林与羊毛脂混合物，盖上盖玻片，相差显微镜下观察。

（2）结果判断。计数卵子受精率和受精指数（FI）。受精率（%）=（受精卵数/卵总数）×100%, FI=穿入卵的精子数/卵总数。一个卵可被多个精子穿透。FI越高说明精子受精能力越强。正常参考值为卵子受精率≥10%。

（3）临床意义。①原因不明不育者检测精子功能。②在女方进行强有力的治疗，如促性腺激素治疗和输卵管成形术前，确定其丈夫精子受精能力。③估计不育症患者精液异常的严重程度，观察治疗效果。④IVF-ET时，评估供精者精液标本的质量和受孕率。⑤检测抗精子抗体对生殖的影响。⑥输精管结扎前，男性受精能力监测。⑦评价化疗或放疗对男性肿瘤患者生育力的影响。⑧估计化学药品、环境中毒物和药物对人精子受精能力的影响。

2．精子-透明带附着试验 精子附着到卵透明带具有物种特异性，是受精的重要前提。精子受精必须附着、穿透透明带，完成顶体反应，再与卵膜融合。等数量的被检测精子与对照精子，分别被发绿色荧光的异硫氰酸荧光素（FITC）和发红色荧光的四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记，混合接种到盐溶液保存的4～6个人卵透明带上，计算被检测精子与对照精子附着到透明带上的比值来预测精子-透明带附着能力。

（1）试验方法。①荧光染料准备：1mg FITC或0.5mg TRITC溶于0.1mol/L KOH溶液中，然后在15s内稀释到5ml含有55.5mmol/L葡萄糖的无菌DPBS缓冲液中，置塑料管中4℃下可保存1周。②人卵准备：将做IVF受精48～60h后显示无双原核或分裂的人卵取出，放于1mol/L硫酸铵中4℃保存2～8周，保存前将卵周围剩余的颗粒细胞通过巴斯德吸管吹吸去除。③精子准备：取被检测与对照的精液各0.4ml,600g分别离心5min后，去上清，加入0.3ml荧光染料FITC或TRITC，置37℃孵育15min后600g再离心10min，去上清，用10ml Tyrode's溶液洗涤，600g再离心10min，用含10%灭活人血清无菌抽滤的Ham F10调整精子浓度为1×106/ml。④试验步骤：将硫酸铵保存的人卵用1ml Ham F10冲洗4次后，加入塑料培养板的每孔中，其孔中事先加好1ml含灭活人血清的Ham F10。取等量分别标记FITC或TRITC的对照和被检测精子混合加到放有卵的塑料培养板的每孔中，置37℃ 5%二氧化碳培养箱中孵育4h。取出人卵后用10ml Tyrode's溶液冲洗3次，用巴斯德吸管吹吸去掉松散附着在人卵透明带周围的精子，将人卵吸到载玻片上，盖上盖玻片轻压，使附着到透明带上的精子均能清楚计数。

（2）结果判断。荧光显微镜下镜检，450～490nm是FITC的激发波长，发绿色荧光；545nm为TRITC的激发波长，发红色荧光，计数发绿色荧光（被检测精子）和发红色荧光（对照精子）精子数，计算被检测精子/对照精子比值。

（二）精子-宫颈黏液相互作用试验

精子-宫颈黏液相互作用试验可判断精子运动功能，分体内试验和体外试验，体内试验即性交后试验（PCT），体外试验主要有毛细管穿透试验和玻片试验。PCT与毛细管穿透试验称精子-宫颈黏液穿透试验，玻片试验称精子-宫颈黏液接触试验。

1．性交后试验 性交后试验即体内宫颈黏液功能检查。精子要到达输卵管壶腹部使卵子受精，需穿过宫颈黏液。宫颈黏液由宫颈管腺细胞分泌，保护精子免遭阴道酸性环境的破坏和巨噬细胞的吞噬，给精子补充能量。正常时射精后数秒钟精子即穿入宫颈黏液，游向宫腔，一部分精子停留在宫颈隐窝内，不断流出，增加卵子受精概率。射精后150min宫颈管内精子密度最大。根据从性交至宫颈黏液镜检时间不同，分为标准试验、早期试验及延期试验（分别为性交后6～10、2～3及18～24h）。

（1）试验方法。时间在排卵期，尽可能在即将排卵前，对月经不规则或内分泌功能紊乱者可行人工周期获取较好的宫颈黏液。试验前禁欲，阴道冲洗3d，午夜或黎明前性交，性交后抬高臀部平卧半小时。检查时用不涂润滑剂窥器张开阴道，暴露宫颈及后穹隆。用不带针头注射器或吸管先吸取阴道后穹隆黏液置玻片上，显微镜检查有无精子，无精子表示精子未射入阴道。有精子则轻轻擦净阴道后穹隆和宫颈外口分泌物，换注射器或吸管或用妇科长钳深入宫颈管内1.5cm，采集黏液涂在玻片上镜检。

（2）结果判断。宫颈黏液中精子活力分级：不活动精子为0级，非前向运动为1级，慢速前向运动为2级，快速直线前向运动为3级。在标准试验中，宫颈口及宫颈管黏液中每高倍视野有10个以上3级精子表示正常。在延迟试验中，宫颈口黏液中活动精子数有所减少，但宫颈管内黏液中活动精子数不应少于每高倍视野5个。世界卫生组织PCT分级诊断标准（分5级，以每高倍视野计）:A级，快速直线运动精子≥50个，无凝集，示正常；B级，缓慢或呆滞直线运动精子≥50个，无凝集，示可疑；C级，非前向运动精子＜10，示可疑免疫因素；D级，无活动精子，示异常；E级，无精子，示异常。亦有分级以每高倍视野＞20个活动活泼精子为优秀，6～20个活动活泼精子为良好，1～5个活动精子为及格，仅有少数不活动精子为较差，无精子者为阴性。

（3）临床意义。PCT检测精子穿透宫颈黏液的能力，反映精子在宫颈黏液中的存活与运动情况。性交后6～8h是测定最佳时期，此时宫颈黏液内有适量活动精子，可排除不孕宫颈黏液因素，说明宫颈黏液功能正常，精子可以穿透宫颈黏液，具有生育正常能力；阴性结果意义相反。标准试验异常，应进行早期试验，以检查精子的穿透力。延迟试验正常则可排除宫颈因素。对初次试验阴性或不正常者应重复试验。

（4）注意事项。PCT受一些因素影响：检查时间不当，如卵泡早期或黄体期，低雌激素影响；内分泌异常，雌激素水平低；子宫或宫颈炎症，炎症细胞与炎性介质改变宫颈黏液性质与黏稠度；宫颈黏液存在抗精子抗体，抑制精子活力；子宫位置异常，如严重子宫前倾前屈或后倾后屈，后穹隆池储存精液异常；宫颈解剖异常，如宫颈狭窄、过长、粘连疤痕等；男性因素，如无精子症、少精子症、畸精子症、弱精子症、精液抗精子抗体阳性、精子有遗传或代谢障碍、阳痿与逆行射精等，精子质量差或没有精子或很少精子进入阴道。

2．毛细管穿透试验 通过体外观察精子是否穿透毛细管内的宫颈黏液或代用品来评价精子功能。可用宫颈黏液代用品，如动情期母牛宫颈黏液、含人血清精子营养液、含牛血清白蛋白精子营养液、鲜鸡蛋清、精浆等，使操作简便，实验条件容易控制，影响因素减少，可成批检测标本。由于使用正常供者的宫颈黏液或宫颈黏液代用品，精子在黏液或代用品内的穿行距离及精子数，完全取决于精子本身的运动能力。

（1）试验方法。试验前禁欲2d。将排卵前夕宫颈黏液或代用品吸入专用毛细管内，顶端胶泥封口，下端插入精液池（深入精液0.5cm）内，垂直放入37℃湿盒内1h，取出毛细管后镜下观察，测量精子在毛细管中穿透高度，记录活动精子数目。

（2）结果判断。使用排卵前夕宫颈黏液者，低倍镜下观察，精子穿透的最远距离小于5mm为无穿透力，6～19mm中等穿透力，20mm以上穿透力良好。WHO推荐根据穿透高度、穿透密度和活力等指标，采用评分法进行判断。3项指标各设4级，分级分值标准：穿透高度（mm）为0（0分）、0～20（1分）、20～50（2分）、＞50（3分）；穿透密度（精子数）0（1分）、1～10（1分）、11～15（2分）、＞15（3分）；活力（毛细管上1/3段前向运动精子比率）0级（无，0分）、Ⅰ级（＜25%,1分）、Ⅱ级（25%～50%,2分）、Ⅲ级（＞50%,3分）。3项累加分数7～9分为优，4～6分为良，1～3分为差，0分为阴性。

（3）注意事项。影响结果的因素主要有精子质量、宫颈黏液性状及试验时的温度。使用精液必须新鲜，应在精液液化后1h内试验；注意保温；如用宫颈黏液应取排卵期宫颈黏液；宫颈黏液或代用品吸入毛细管时不可有气泡，以防气泡阻止精子向前运动。

3．玻片试验 宫颈黏液与精液均有一定的表面张力，两样品接触时可形成明显的界面。精子可由突起处向黏液穿透。领先精子穿透界面后，其他紧随其后，前向运动力强的精子不断穿入黏液深部。

（1）试验方法。方法1：取洁净玻片1张，相距4mm分别滴加排卵期宫颈黏液或代用品和1滴液化精液，轻轻盖上盖玻片，使两滴相互接触但不重叠，37℃孵育10～15min后镜下观察。方法2：将一滴宫颈黏液置载玻片上，用盖玻片铺平，两片之间的厚度用硅化的玻璃珠控制，在载玻片两侧各滴一滴精液，使与盖玻片边缘接触，借毛细作用将精液移向盖玻片，使宫颈黏液与精液之间现一清晰接触界面，37℃孵育30min后镜下观察。精子在接触界面处形成一指状突起伸入黏液，精子穿过指状突起进入黏液，然后呈扇形散开运动。

（2）结果判断。方法1：以紧邻界面第1个高倍视野和第2个高倍视野中活动的精子数判断结果。第1个高倍视野精子数，0为阴性，～5为差，～15为良，～25为优；第2个高倍视野精子数，0为阴性，～1为差，～10为良，～25为优。方法2：精子穿透黏液，并有90%以上具有明确直线运动的活动精子时为正常结果；精子穿透黏液，但离开黏液与精液接触面＜500μm为较差；精子穿透黏液，但很快失活或仅作摆动为异常结果；精子未穿透精液与黏液的接触界面，界面的精液侧凝集为异常结果。本试验有一定主观性，在平面玻璃上使精液黏液接触界面的大小和形状完全标准化是不可能的，只能定性评价精子与黏液的相互作用。

（三）精子膜功能试验

精子膜功能与精子获能、顶体反应及精卵融合密切相关。精子膜的完整性和功能性对精子存活及受精非常重要。测定精子膜完整性是基于精子膜半渗透性原理，膜完整的精子在低渗溶液中水进入精子细胞内以维持细胞膜内外渗透压平衡而肿胀，膜异常与死精子则无维持细胞膜内外渗透压平衡能力而不发生肿胀。膜功能正常精子不易渗入染料而不着色。精子膜功能测定，可预测精子的受精能力。精子膜功能试验主要有精子尾部低渗肿胀试验（HOST）和伊红Y水试验。

1．精子尾部低渗肿胀试验 精子尾部膜比头部膜更柔软疏松，进入尾部的液体较多，使体积及形态改变较大，精子肿胀现象在尾部易观察到。精子头部胞质少，质膜与核膜接触紧密，精子头部肿胀率明显低于尾部。精子膜功能不全的精子（包括死精子）表现为不膨胀。

（1）试验方法。取完全液化的精液0.1ml，用BWW培养液调整精子密度为（2～10）×106/ml，加入37℃水浴（5min）的离子浓度0.15mol/L低渗溶液（枸橼酸钠7.35g、果糖13.5g,加蒸馏水至1000ml）0.85ml于试管中混匀，37℃水浴30min，取20μl置载玻片上，加盖玻片，在400倍相差显微镜下观察精子尾部肿胀情况，计数200个精子，算出尾部肿胀率。亦可用双蒸水取代枸橼酸钠-果糖低渗溶液进行试验。

（2）结果判断。尾部肿胀可表现为尾完全肿胀、粗短肿胀、弯曲肿胀、尾尖弯曲肿胀、尾尖肿胀伴弯曲膨胀、尾尖肿胀等类型。有研究表明，精子尾总肿胀率为生育组（34例）（76.28±6.87）%，不育组（84例）（55.18±16.31）%。以精子尾部肿胀率＞60%正常，＜50%为异常，60%～50%为可疑。HOST临床价值尚有争议，能否预测精子受精能力有不同看法。

2．伊红Y水试验 伊红Y水试验除检测精子尾部肿胀率反映精子膜功能完整性外，还可检测精子头部未着色率来评估精子头部膜结构的完整性，预测精子受精能力。

（1）试验方法。取新鲜完全液化精液，37℃水浴5min，取10μl精液和40μl 1g/L伊红Y水溶液（5g伊红Y溶解于100ml 0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液中）于载玻片上混匀，盖上盖玻片，静置1～2min，高倍镜下观察200个精子，计算头部未着色率和尾部肿胀率。

（2）结果判断。有研究表明，精子头部未着色率、精子尾肿胀率分别为生育组（61例）（71.87±10.45）%、（72.67±9.95）%，不育组（72例）（58.31±17.95）%、（59.19±18.21）%。以精子未着色率与尾肿胀率＞60%为正常，＜50%为异常，60%～50%为可疑。试验结果与精子活力、正常形态及存活率相关，与精子畸形率呈显著负相关，与精子密度、精液量、pH、液化时间无关。生殖道感染患者精子低渗肿胀率显著低于非感染者。

（四）精子核功能试验

精子核是精子重要的细胞器。精子发生过程中，各期生精细胞核内DNA的含量发生规律性变化，与核DNA结合的核蛋白也发生组型转换，即从组蛋白（histone Protein, HP）→过度蛋白（transition protein, TP）→鱼精蛋白（精蛋白或精核蛋白，protamine），从而决定精子的核成熟度。成熟的精子核内DNA与鱼精蛋白紧密结合，高度浓缩，抑制了基因的表达，使遗传物质保持稳定。精子核DNA成熟度与精液参数无关，但直接影响精子受精能力和受精后原核形成及胚胎着床，与精子能育性有关，可作为预测精子能力的指标。精子核功能试验主要有精子核DNA荧光染色、精子核染色质抗解聚试验、苯胺蓝染色检测精子核蛋白组型转换试验、色霉素A3检测、精子核蛋白组分测定等，本节只介绍前3种。

1．精子核DNA荧光染色（吖啶橙诱发透光试验）精子核约占精子头部65%，由鱼精蛋白和DNA组成。成年男性排出的精子有双链DNA精子和单链DNA精子，只有双链DNA精子才有受精能力。精子发生过程中，鱼精蛋白逐步取代HP与DNA结合。精子在附睾成熟过程中，鱼精蛋白大量的巯基不断氧化成二硫键与DNA紧密结合，使DNA更具抗酸能力，维持双链结构的稳定。不成熟精子鱼精蛋白中多数巯基未被氧化，DNA在酸作用下变性成单链。荧光染料吖啶橙（AO）可与双链DNA结合呈单体形式发出绿色荧光，与单链DNA结合呈聚合物形式发出红色或黄色荧光，这样可区分双链和单链DNA精子，反映精子核DNA成熟度，评估男性生育能力。

（1）试验方法。将液化精液1.0ml用pH7.4的0.01mol/L PBS离心洗3次，弃上清液，加PBS于沉淀中，调整精子浓度为20×106/ml，涂片，室温晾干，甲醇固定。加3滴新配制的吖啶橙混合染液（0.1g/100ml吖啶橙1.0ml、1.91g/100ml柠檬酸溶液4.0ml、10.74g/100ml磷酸氢二钠溶液0.25ml，用前配制）染色5min，流水冲洗，晾干。

（2）结果判断。荧光显微镜观察，计数300个精子中绿色、红色或黄色精子数，计算有受精能力的绿色荧光精子的百分率（即双链DNA精子），正常＞66%。绿色荧光精子（成熟精子）＜50%的夫妇均无怀孕，该值是低能性精液的评估界线。能否怀孕不全由精液参数高低决定，绿色荧光精子率也参与决定精子的生育性。只有绿色荧光精子才能与透明带、卵子结合。绿色荧光精子率相对稳定，既不同于不同时期精液各参数自身对比有较大幅度波动，也不随对精液质量的有关治疗而变化，提示附睾中精子成熟障碍不易克服，此法能揭示精液分析不能反映的精子能育性，对精液参数正常的精液尤为重要。

2．精子核染色质抗解聚试验 精子核因大量二硫键的存在呈高度浓缩，使DNA处于高度稳定状态。EDTA-SDS（乙二胺四乙酸-十二烷基硫酸钠）能打开鱼精蛋白分子中的二硫键。当精子核内组蛋白含量过多时，阻碍了鱼精蛋白与DNA紧密结合，使核的结构较为松散，稳定性下降。经EDTA-SDS作用后，核出现膨胀，呈解体状态。精子核抗解体能力反映了精子核成熟的程度。

（1）试验方法。精液液化后离心去精浆，精子用硼酸盐缓冲液洗2次，精子沉淀加入1ml EDTA-SDS溶液，混匀，37℃孵育60min，再加入等体积的戊二醛溶液，终止反应。取1滴加在玻片上，盖上盖玻片，相差显微镜高倍镜下计数200个精子中头部未解聚的比例。也可将反应物涂片干燥后Feulgen染色，普通显微镜下同上观察计数。

（2）结果判断。正常生育男性精子核未解聚比率应＞70%。

3．苯胺蓝染色检测精子核蛋白组型转换试验 精子核蛋白组型转换发生在精子细胞阶段。圆形精子细胞伸长时，首选合成TP取代HP。到晚期精子细胞，TP又被鱼精蛋白所取代。人成熟精子中仍然保留了少量的HP和TP。鱼精蛋白分子中富含精氨酸和胱氨酸，一般不含有赖氨酸，而HP和TP中则有大量赖氨酸。苯胺蓝可与富含赖氨酸的蛋白结合，呈蓝色，以此来显示精子核蛋白组型转换。

（1）试验方法。禁欲3～7d的精液，37℃水浴至完全液化，以BWW培养液调整精子密度（10～20）×106/ml，均匀涂片，自然干燥，用3%戊二醛固定30min，空气干燥30min,5%苯胺蓝染色3～5min,95%乙醇洗1次，100%乙醇洗2次，二甲苯透明2次（5～10min），加拿大树胶封固，显微镜下计数400个精子中染色阳性（蓝色）的精子和非着色精子的百分率。

（2）结果判断。一般正常生育男性苯胺蓝阳性精子≤30%。精子核内HP大量存在，阻碍鱼精蛋白与DNA正常结合，可使精子核DNA稳定性下降。同时，受精后使精子核不能解聚形成原核，影响雌雄原核融合，可导致受精失败、胚胎不能正常发育而流产。

（五）精子顶体反应与顶体酶活性测定

获能的精子到达卵细胞附近时所发生的一系列变化称为顶体反应。人类精子顶体位于精子头前端，覆盖在精子核前面，由顶体帽和赤道板组成，是一个膜结合的帽状结构。顶体内含有多种蛋白水解酶和磷酸酯酶。精子与卵子接触激发顶体反应，精子顶体小囊内释放出水解酶，如放射冠穿透酶、玻璃酸酶和蛋白水解酶，卵子的膜被酶分开，使精子穿透透明带。精子只有在体内经过获能、顶体反应，才能完成受精，没有顶体反应受精无法进行。检测精子是否发生顶体反应有助于预测精子受精能力。精子顶体缺乏是精子穿卵率低的重要原因，是男性不育原因之一。

顶体反应发生需要精子获能，在体外需要诱发因素。一般认为，钙离子内流启动正常的顶体反应。钙离子载体A23187通过钙离子通道诱发顶体反应，是常用的诱导剂。通过对钙离子载体引发顶体反应后的顶体状态进行评估，可鉴定顶体反应障碍。包被糖蛋白、囊性脂肪、卵-冠-丘复合物、透明带、整个卵和孕酮也可诱发人精子发生顶体反应，且透明带诱导顶体反应具有种间交叉性，小鼠透明带溶液可诱导人精子发生顶体反应。顶体反应受多种因素影响，常见的生殖道感染，如解脲脲原体感染可引起顶体膜破坏，造成顶体反应降低或消失。

1．精子顶体反应测定 精子顶体反应测定有凝集素亲和荧光法、考马斯亮蓝染色法、金霉素荧光染色法、间接免疫荧光法、免疫珠结合试验等多种方法，本书介绍前2种。

（1）凝集素亲和荧光法。精子顶体膜含有大量糖蛋白，能与植物凝集素特异性结合，借助荧光素如异硫氰酸荧光素（FITC）或四甲基异硫氰酸罗明（TRITC）标记凝集素，在荧光显微镜下观察精子荧光反应来预测顶体反应。凝集素很多，如豌豆凝集素（PSA）、刀豆球蛋白（ConA）、蓖麻凝集素（RCA）、花生凝集素（PNA）和荆豆凝集素（UEAA）等，经典的是PSA。不同凝集素有相应的受体蛋白，它们不仅单纯用于检测顶体反应，而且运用多种检测技术共同作用，观察整个顶体反应过程，可以探索顶体反应过程中顶体区域各种糖蛋白的表达变化，对研究顶体反应的相关因子有一定意义。利用钙离子载体A23187诱导精子发生顶体反应，精子发生顶体反应后顶体丢失。可用能与精子顶体中大量糖蛋白的糖基结合的PSA作为探针，检测精子顶体反应。

1）试验方法。液化精液1ml，置无菌玻璃试管中，上层轻轻加入5ml BWW液（含3.5g/L人血清白蛋白）,45°倾角37℃上游30min，取上层活力良好的精子1000r/min离心10min，精子沉淀用BWW液调整至（1～10）×106/ml。37℃孵育5h，使精子获能，之后加入A23187使其终浓度为10μmol/L,37℃再孵育1h，诱导顶体反应。1000r/min离心10min，沉淀用适量PBS悬浮后涂片晾干，甲醇中固定30s，迅速干燥。用TRITC-PSA染色30min，蒸馏水冲洗后浸泡15min，晾干。

2）结果判断。荧光显微镜下观察，可见3种类型精子，即顶体帽无荧光或仅核有荧光，为发生顶体反应的精子；顶体完整有荧光而核无荧光，为顶体完整的活精子；整个精子有荧光为死精子。计数100条精子中第1种精子的百分率。正常生育男性精子顶体反应发生率≥75%。

（2）考马斯亮蓝染色法。考马斯亮蓝是常用的蛋白质染色剂，可将精子顶体膜上的糖蛋白染成紫蓝色。利用钙离子载体A23187诱导精子发生顶体反应，发生顶体反应后的精子顶体丢失，顶体区不着色，顶体完整而被考马斯亮蓝染上紫蓝色的精子为没有发生顶体反应的精子。

1）试验方法。精子获能与顶体反应同凝集素亲和荧光法。发生顶体反应的精子悬液1000r/min离心10min，沉淀用4%甲醛-PBS悬浮，固定10min，涂片，自然干燥，考马斯亮蓝染色30min，用蒸馏水冲洗后晾干，显微镜下观察。

2）结果判断。计数100条精子中顶体未着色（发生顶体反应）精子的百分率，即为顶体反应率。正常生育男性精子顶体反应发生率≥75%。

2．精子顶体酶活性测定 顶体酶是一种与精子顶体膜相连的胰蛋白样丝氨酸蛋白酶，以酶原形式合成，储存于顶体内。顶体反应开始后，顶体酶原被激活成顶体酶并释放出来，溶解卵细胞透明带，通过精子强烈的活动力及楔样作用协助精子穿透透明带。顶体酶活性高低可直接影响受精，测定精子顶体酶活性对判断男性精子功能和生育力有一定意义。检测精子顶体酶的试验主要有明胶底膜法检测单精子顶体酶活性的强弱、阳性反应率及反应时间出现的早晚，精子精氨酸酰胺酶活性测定来反应顶体酶全部活性。

（1）明胶底膜法。顶体酶中含有多种蛋白水解酶。精子在明胶制成的薄膜上孵育后，引起顶体解聚，释放出顶体酶，将明胶溶解成亮环，酶活性大小可依据亮环直径大小判断。

1）试验方法。①制备34g/L明胶膜：3.4g明胶加双蒸水100ml于100℃溶解后降至56℃, 滴加于洁净的玻片上，每张1.0ml，立即推成薄膜，然后置于4℃冰箱3～5min，呈凝胶状，转置室温下干燥20h，用0.05%戊二醛（50μl戊二醛加pH7.0的巴比妥钠盐酸缓冲液至100ml）固定2min后，用0.05mol/L pH7.0的巴比妥钠盐酸缓冲液（1.03g巴比妥钠加蒸馏水100ml, 0.1mol/L HCl调pH7.0）洗2次，每次10s，蒸馏水冲洗6次，滤纸吸去水分，室温干燥1h，用0. 5%台盼蓝溶液染色10s，滤纸吸去多余染液。②顶体酶活性测定：液化精液2000r/min离心10min，去除上层精浆，用PBS（0.01mol/L, pH7.4）洗2次后悬浮于PBS中，取悬液1滴滴加于制备好的明胶膜上，均匀涂开，37℃湿化盒中孵育2h后取出，自然干燥。

2）结果判断。显微镜下观察，计数出现亮环的精子数，计算阳性率，并测量亮环直径，亮环直径表示酶活性大小。正常生育男性阳性率＞60%，亮环直径＞120μm。

（2）精子精氨酸酰胺酶活性测定。精子顶体中有精氨酸酰胺酶，其活性可以反映顶体酶全部活性。精氨酸酰胺酶以Nα-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺（BAPNA）为底物，分解产生有色产物硝酰基苯胺，通过测定硝酰基苯胺的产量可推算出精氨酸酰胺酶的活性。

1）试验方法。试剂有Ficoll溶液（NaCl 0.7g, Hepes 0.7g, Ficoll400聚蔗糖11.0g，加水至100ml, pH7.4）、Triton溶液（NaCl 0.32g, Hepes 1.31g, Triton X-1001.0mg，加水至100ml, pH 8.0）、终止液（苯甲脒8.73g，加水至100ml）、BAPNA液（5mg BAPNA用0.5ml二甲亚砜溶解）及反应液（9份Triton溶液+1份BAPNA液）。

液化精液计数后按10×107精子/管计算出所需精液量，加入0.5ml Ficoll溶液，2000r/min离心15min，弃上清液，用100μl Ficoll溶液悬浮，分别加入装有1.0ml反应液的测试管和对照管中，然后在对照管中再加入终止液100μl,24℃孵育3h，每隔1h震荡1次，孵育结束后于测试管中再加入终止液100μl，两管分别以2000r/min离心15min，取上清液，400nm测吸光度（A）值，以反应溶液调零。

2）结果判断。顶体酶活性 =[（测定管A值-对照管A值）×106/（1485×10）]（×106 U/106精子）。24℃水解BAPNA1.0μmol/min为1U顶体酶活性。有报道正常生育男性顶体酶活性为（29.7±14.3）×106U/106精子。

（六）精子线粒体功能测定

精子线粒体位于精子尾部的中段，形成线粒体鞘结构。哺乳类动物每个精子约含有75个线粒体。线粒体是精子运动能量提供场所。线粒体鞘局部或完全缺失，线粒体的体积及分布异常，都可能使精子运动能力发生障碍而导致不育。在弱精子症和死精子症中，可见大量线粒体缺陷存在。检测线粒体功能的试验主要有硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium, NBT）法测定线粒体功能及精子线粒体DNA测定。

1．NBT法检测线粒体功能 琥珀酸脱氢酶（SDH）是线粒体的标志酶之一，其活性降低可影响精子能量代谢，造成精子运动能力下降。SDH可将琥珀酸氧化生成延胡索酸，脱下的H+通过中间氢受体吩嗪甲基硫酸酯（PMS）将硝基四氮唑蓝还原为二甲，呈蓝紫色颗粒。

（1）试验方法。取1滴液化精液和1滴NBT溶液于洁净载玻片上，混匀后盖上盖玻片，湿盒中37℃孵育30min，取出后将液滴涂匀，自然干燥，中性福尔马林固定2h，漂洗晾干后，镜下观察。

（2）结果判断。生育男性正常线粒体精子＞70%。

2．精子线粒体DNA检测 人类线粒体DNA（mtDNA）为双链闭合环状结构。成熟精子每个线粒体一般只含一个mtDNA。精子线粒体可利用女性生殖道的能源物质，通过氧化磷酸化产生大量ATP，使精子运动能力明显提高，为完成穿卵受精过程创造条件。mtDNA缺失是导致精子运动能力降低的原因之一。设计人特异的mtDNA PCR引物。提取精子DNA后用PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

（1）试验方法。液化精液2000r/min离心15min，弃精浆，精子沉淀用生理盐水洗3次，弃尽上清液。再用300μl TES缓冲液充分悬浮，加入80μl 5mol/L NaClO4,100μl 10%SDS，混匀。置37℃10min，溶液清亮后再置65℃15min，加入等体积的饱和酚溶液，混匀，2000r/min离心10min，取上清液，加2倍体积的-20℃无水乙醇，2000r/min离心10min后弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2～3次，弃上清液，真空抽干，用20～30μl双蒸水溶解，取0.4μg DNA为模板，进行PCR反应。反应总体积50μl，含200μmol/L dNTPs,0.2μmol/L引物（1对）,1U Taq酶，50mmol/L的KCl,1.5mmol/L的MgCl2,10mmol的Tris-HCl（pH8.3）, 0.4μg DNA为模板。反应条件：95℃变性5min，加Taq酶，94℃1min,60℃1min,72℃1min，循环30次，最后72℃延伸7min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照射，观察结果。

（2）结果判断。有报道，100例男性不育组线粒体ATP合成酶基因（MTATP8）缺失率为15%,30例生育组精子中未检出MTATP8基因缺失。线粒体DNA缺失是男性不育病因之一。

三、精液非精子细胞检查

精液检查时除精子细胞外，有少量的非精子细胞成分，可分为3大类：①未成熟生精细胞，包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、早期精子细胞、晚期精子细胞、无核胞浆体。②外周血细胞，如生殖道感染疾病可见到红细胞、白细胞。③凋亡细胞、支持细胞、生殖道上皮细胞等其他细胞。对于生精细胞，精液中不仅可检查出正常的生精细胞，也可检查出异常的生精细胞。用普通光学显微镜常规涂片检查无法准确区分这些细胞成分。通常用联苯胺法、正甲苯胺蓝过氧化酶染色检查精液中白细胞成分，但后者不能发现不含过氧化酶的白细胞。为更准确确定精液细胞成分，可用免疫细胞化学法检测。不同类型的生精细胞可用Bryan-Leishman染色检测。

将精液中非精子细胞称为圆形细胞。按世界卫生组织《人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》（第4版）标准，正常精液圆形细胞不应＞5×106/ml，其中白细胞＜1×106/ml。精液白细胞过多提示附属性腺有炎症。正常人未成熟生精细胞＜1%，过多可能与精索静脉曲张、精曲小管功能受损有关。

四、精液生化测定

男性附属性腺主要包括前列腺、精囊腺、尿道球腺，附属性腺及附睾的功能对男性生育有重要意义。精浆几乎都由附属性腺分泌物组成，其中约30%来自前列腺，60%～70%来自精囊腺，其余5%～10%来自附睾和尿道球腺等。精浆90%为水分，其他成分主要有糖类、脂类、蛋白质、肽类激素、氨基酸、胺类和有机酸等。精浆中有许多成分的浓度明显高于血液中的浓度，这对维持精子的功能和活性具有重要的意义。

任何附属性腺及其输送管道的缺如、阻塞和炎症等，都会导致精浆中某些成分发生变化。精浆中的一些生化标志物可反映附属性腺的功能，如柠檬酸、锌、镁、γ-谷氨酰基转移酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能；果糖和前列腺素可反映精囊功能；游离左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和α-葡萄糖苷酶反映附睾功能等。这些特异性标志物总排出量高低反映了男性附属性腺的分泌功能状态，可用于评价男性附属性腺的分泌功能，对男性不育病因及发病机制的分析、诊断与治疗有重要的意义。

（一）精浆酸性磷酸酶测定

精浆酸性磷酸酶测定包括磷酸苯二钠法与p-硝基酚比色法。本节介绍磷酸苯二钠法。酸性磷酸酶（ACP）在酸性条件下酶促分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化成红色醌的衍生物，根据红色深浅可测出酸性磷酸酶的活性高低。

1．测定方法 ①试剂：0.2mol/L枸橼酸缓冲液（枸橼酸盐42g溶于800ml水中，用NaOH校正pH4.9，加蒸馏水至1L，加氯仿数滴）;0.1mol/L磷酸苯二钠基质液（取无水磷酸苯二钠2.18g，如含2分子结晶水应加2.54g，加水至1L，迅速煮沸，冷却后加氯仿数滴防腐）；碱性溶液（NaHCO34.2g,4-氨基安替比林0.1g，溶于100ml蒸馏水中，加入0.5mol/L NaOH 100ml混匀）；铁氰化钾溶液（铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各溶于400ml蒸馏水中，二液相混，加水至1L，棕色瓶暗处保存）；酚标准液（加酚1g于0.1mol/L HCl中，用0.1mol/L HCl稀释至1L）。②方法：将精浆用等渗盐水稀释1000倍后，按表3-2、表3-3方法操作。

2．结果判断 以测定管吸光度-对照管吸光度，查标准曲线求酶活力。每毫升精浆在37℃与基质作用15min，产生10mg酚为1U。正常值为48.8～208.6U/ml。

3．临床意义 精浆ACP几乎全部来自前列腺，测定ACP可了解前列腺功能和诊断前列腺疾病。ACP活力下降，说明前列腺功能低下，可见于前列腺炎；ACP活性增高可见于前列腺癌和前列腺肥大，活力显著增高，对诊断前列腺癌有重要意义。精浆ACP有促进精子活动作用，ACP减低，精子活动力减弱，可引起受精率下降，导致不育。标本中ACP极易被破坏，应及时测定。

（二）精浆γ-谷氨酰基转移酶测定

精浆中γ-谷氨酰基转移酶（γ-GT）可分解γ-谷氨酰-α-萘酚为游离的α-萘酚，α-萘酚与重氮试剂作用产生红色，其色泽深浅与γ-谷氨酰基转移酶含量成正比。

1．测定方法：①试剂：硼酸缓冲液（硼酸3.092g、KCl 3.728g，溶于500ml蒸馏水中，加1mol/L NaOH 21.4ml，加水至1L, pH 9.0）；基质缓冲液（取γ-谷氨酰-α-萘酚27.1mg，加pH 9.0硼酸缓冲液10ml，加热助溶，溶解后即置冷水中冷却，冰箱保存）；重氮试剂（氨基苯磺酸2g溶于400ml水中加热，冷却后加冰乙酸200ml，再稀释至1L；亚硝酸钠0.1g溶于100ml水中。临用时取前液96ml、后液4ml混合）；α-萘胺标准液（2μmol/ml，取α-萘胺143mg溶于无水乙醇10ml中，加水至500ml，用前配制）。②方法：精浆用生理盐水稀释10倍后按表3-4、表3-5操作。

2．结果判断 测定管吸光度-空白管吸光度，查标准曲线即可得γ-GT活力。每毫升精浆在37℃与基质作用30min，释出α-萘胺0.5μmol为1U。参考值为69.3～206.5U/ml。

3．临床意义 精浆中γ-GT活力高低反映前列腺功能，与酸性磷酸酶意义相同。

（三）精浆柠檬酸测定

精浆去蛋白后，精浆中柠檬酸与醋酐、吡啶作用形成胭脂红色产物，其颜色深浅与精浆中柠檬酸含量成正比。

1．测定方法（紫外比色法）①试剂：Boehringer药盒No.139076,1号瓶加12ml蒸馏水重组成溶液1, -20℃储存；2号瓶（柠檬酸裂解酶）加蒸馏水重组成溶液2, -20℃储存。TRA缓冲液：14.9g三乙醇胺溶于750ml蒸馏水中，加浓盐酸调pH7.6;0.027g ZnCl2溶于250ml蒸馏水中；加ZnCl2溶液于三乙醇胺溶液中；加0.5g叠氮钠。②方法：将精液3000g离心15min，或2000g离心20min，加0.1ml精浆于4.95ml 15%（150ml/L）三氯乙酸中，加0.75ml 6mol/L NaOH, pH超过7。将0.5ml 1号液，2.3ml TRA缓冲液、0.2ml精浆提取液加在一个比色杯中，混合，在340nm波长处测定吸光度A1；加20μl 2号液，混合15min，测定吸光值A2。

2．结果判断 柠檬酸浓度（mmol/L）=（A1-A2）/139。参考值≥52μmol/L次射精。

3．临床意义 柠檬酸主要来自前列腺，能与钙离子结合，影响排精后精液的凝固和液化过程。对维持透明质酸酶活性和精子活力有重要作用。柠檬酸与钾、钠离子结合，起到维持精液内的渗透平衡作用，并影响精子活动力。前列腺炎症时，含量显著减少。精液中柠檬酸水平和血液中睾酮水平成正比，故柠檬酸可能在某种程度上间接反映出体内雄激素的分泌。

（四）精浆果糖测定

测定精浆果糖方法有间苯二酚法与吲哚显色法。本节只介绍间苯二酚法。精浆中果糖在强酸、高温环境中与间苯二酚作用生成红色化合物，其颜色深浅与果糖含量成正比，与标准比色可得其含量。

1．测定方法 ①试剂：0.175mol/L ZnSO450g/L;0.15mol/L Ba（OH）2·8H2O 47.3g/L;1g/L间苯二酚用95%乙醇配制；10mol/L的HCl，于87ml蒸馏水中加入浓HCl 413ml；果糖标准液50mg/L；果糖标准储存液：50mg果糖加蒸馏水至100ml。②方法：取精浆0.1ml，加蒸馏水2.9ml混匀，加0.5ml的0.15mol/L Ba（OH）2,0.5ml的0.175mol/L ZnSO4，混匀，静置5min，离心取上清液备用，再按表3-6操作。

2．结果判断 果糖（g/L）=（测定管吸光度-标准管吸光度）×2。参考值0.87～3.95g/L。

3．临床意义 精浆果糖是精子活动的能源。精液果糖由精囊分泌，测定果糖可了解精囊功能。果糖分泌还受睾酮调节，可以间接推测睾酮水平，了解睾丸间质细胞的功能。精浆果糖浓度减低时精子活动力减弱，影响受精。精浆果糖阴性或含量降低，常见于先天性精囊输精管缺如和发育不良、精囊炎、雄激素水平低下等。

（五）精浆α-葡糖苷酶测定

麦芽糖含有两个吡喃型葡萄糖残基，由α-1,4-糖苷键相连，经α-葡糖苷酶作用，水解糖苷键生成葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶法测定其生成量。亦有采用硝基酚-α-吡喃葡萄糖苷在α葡糖苷酶的作用下生成硝基酚，在碳酸钠的作用下显色方法进行检测，本书不介绍此法。

1．测定方法 ①试剂：醋酸盐缓冲液0.1mol/L, pH5.2；麦芽糖基质液：麦芽糖100mg溶于5ml的0.1mol/L醋酸盐缓冲液中，用时配制；Tris-HCl缓冲液：0.5mol/L,pH7.0；葡萄糖标准液：2mg/ml;9.0g/L氯化钠溶液；葡萄糖酶法测定试剂盒（解放军南京军事医学研究所）。②方法：见表3-7。

2．结果判断 1U α-葡糖苷酶=每毫升精浆与底物在37℃作用30min产生0.1mg葡萄糖，精浆α-葡萄糖苷酶活性=（U -Ub-Rb）/（S-Rb）×0.01×2×1/0.01÷0.1。参考值35.1～87.7U/ml。

3．临床意义 附睾上皮能分泌α-葡糖苷酶，精浆α-葡糖苷酶活性一定程度上反映附睾功能。对某些与附睾有关的不育症，如阻塞性无精子症，α-葡糖苷酶活性下降具有肯定的诊断价值；对鉴别输精管阻塞病变与睾丸生精障碍所致的无精子症具有一定意义。

（六）精浆肉毒碱测定

精浆中肉毒碱和乙酰辅酶A反应，在肉毒碱酰基转移酶催化下生成乙酰肉毒碱和辅酶A。辅酶A与埃尔曼试剂（5,5'-二硫-2-硝基苯甲酸，DTNB）作用生成黄色产物5-硫-2-硝基苯甲酸，其颜色深浅与辅酶A含量成正比，可算出精浆中肉毒碱的浓度。此法称埃尔曼试剂法。

1．测定方法（1）试剂：0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH7.5；氯仿、异丁醇混合液，按2∶1比例配制。DTNB溶液：用Tris-HCl缓冲液配成2μg/L浓度。乙酰辅酶A溶液：临用时用Tris-HCl缓冲液配成8mg/ml浓度。肉毒碱酰基转移酶（ACT）溶液：临用时用Tris-HCl缓冲液将酶原液（80μmol/mg蛋白特异活性）稀释30倍。肉毒碱标准液：L-肉毒碱用Tris-HCl缓冲液配制成8mmol/L，临用前稀释80倍使成0.1mmol/L浓度的应用液。（2）方法：取精浆0.15ml，加95%乙醇0.75ml，混匀，室温放置2h后3000g离心20min，取上清液，40℃以下减压蒸发至干燥；干燥物溶于3ml蒸馏水中，加4ml氯仿、异丁醇混合液混匀，5min后3000g离心20min，取上层水液2ml于试管中，40℃以下减压蒸发至干燥，备用；B为空白管，U为已制备的干燥样品管，S为标准管，按表3-8操作。

2．结果判断 绘制标准曲线：以肉毒碱含量100、200、400、600、800nmol/ml为标准点，和所测吸光度回归绘制标准曲线。正常参考值（461.56±191.63）nmol/ml。

3．临床意义 精浆肉毒碱主要由附睾分泌（约90%精浆肉毒碱来源于附睾），精囊分泌少量肉毒碱。精浆肉毒碱含量间接反映附睾功能。精浆肉毒碱含量几乎高于血浆肉毒碱10倍。肉毒碱与精子成熟有关，参与脂肪酸氧化过程，可转运长链脂肪酰辅酶A进入线粒体内膜进行β氧化，作为脂肪酸代谢重要辅助因子为精子在附睾内成熟提供必要的能量来源。精浆肉毒碱水平降低见于输精管缺如、梗阻性无精子症、附睾炎症等患者。

五、微量元素测定

利用原子吸收光谱学检查，测定锌、铅、镉等原子激发的光线吸收度。每种金属都有其独特的反应吸收线，相当于光源的波长，吸收光线的量与金属原子吸收数成正比。

1．锌 前列腺含锌量较其他组织多，锌的含量与前列腺液抗菌能力有关。锌还可能参与稳定精细胞膜。前列腺炎时，锌含量降低，特别是细菌性前列腺炎，锌含量明显降低。

2．铅 铅为机体有害元素。铅从不同的环节对男性生殖有影响：①损害睾丸生精细胞，可致睾丸变性。②精子发生过程中导致精子畸变。③直接抑制精子活力及导致精子死亡，活率下降。④铅先活化然后灭活精子表面甘露糖结合位点，从而影响顶体反应发生。⑤铅抑制男性附属性腺双氢睾酮与雄激素受体结合，从而影响内分泌功能。

3．镉 镉为机体有害元素。镉及其化合物通过消化道、呼吸道进入体内，主要分布在肾、肝等脏器，睾丸的含量也很高。在体内蓄积可引起自身免疫性睾丸炎，损伤睾丸血供和影响睾丸功能。镉可阻断精原细胞DNA合成，使精子发育障碍，镉在体内蓄积可影响锌在体内的代谢从而间接影响生殖功能。

4．硒 精浆硒主要来自前列腺，硒为谷胱甘肽过氧化物酶的重要活性成分，对维持精子良好的形态结构和功能起重要作用。硒是精子线粒体外膜硒蛋白的成分之一，对维持精子线粒体螺旋状排列结构起重要作用。硒还参与生精上皮的合成及精子早期的发生过程。另外硒还能中和镉、铅、铜、汞等其他有害元素的毒性，对一些有害元素损害生殖系统可起到一定的保护和预防作用。精浆硒水平过高或过低均会影响生殖功能，精浆中的硒与不育密切相关。慢性前列腺炎患者精浆硒降低。解脲脲原体感染对前列腺分泌功能有影响，精浆硒降低明显。无精子症患者精浆硒显著降低。

5．铜 铜是精液的正常成分，一定的铜浓度对维持精子运动是必需的，但铜含量升高可导致男性不育。铜能抑制精子线粒体功能，致使精子活力减弱或丧失，且影响精子存活率和穿透宫颈黏液的能力，还能干扰受精卵的着床。铜升高一方面直接影响精子生殖功能，另一方面还通过干扰垂体内分泌腺的分泌功能（可致LH分泌降低）而影响男性生育。

6．铁 铁缺乏或铁过多均影响睾丸正常发育和生理功能，对生殖有不利影响。铁过多可致生殖器官发育不良、性功能紊乱及睾丸曲细精管管壁上大量铁粒积聚；铁不足可致性腺功能减退，可能由于营养缺乏导致促性腺激素分泌减少。

7．锰 锰与性腺功能密切相关。锰为多种酶的激活剂，精浆锰含量与精子活率、活力及运动速度均有明显相关性。体内过多的锰可在睾丸蓄积，干扰和抑制生精过程导致少精或无精。

第二节 免疫功能检查

免疫因素与男女不孕不育的发生有密切关系。本节介绍常见的引起不孕不育的免疫学检查方法，包括抗精子抗体检测及精浆免疫抑制物测定。与女性不孕关系更密切的免疫学检查在第二章第五节介绍。

一、抗精子抗体检测

精子有较强的抗原性，男性或女性生殖道损伤，精子抗原进入血循环或淋巴系统，激活免疫系统引起免疫应答，产生抗精子抗体（AsAb）。AsAb有IgG、IgA、IgM，存在于男女血液与生殖道分泌物（如精液和宫颈黏液）中。首先出现的是IgM类，随后是IgG类，可长期存在。血清以IgG、IgM类为主，局部体液以IgA类为主，且更具有意义，但精浆、子宫颈黏液阳性率明显低于血清。不明原因不育夫妇AsAb阳性率：血清IgG 19.10%、IgA 12.47%、IgM19.74%，精浆IgG 4.40%、IgA 9.0%、IgM＜1.0%，宫颈黏液IgG 9.7%、IgA 16.71%、IgM2.0%。说明血清阳性率大于精浆，以IgG、IgM类为主；精浆和宫颈黏液以IgA类为主（上海第二医科大学上海生殖医学研究培训中心）。精液中AsAb几乎全部为IgA和IgG，引起精子凝集和制动，抑制精子顶体活性，使之难以穿透放射冠和透明带，阻碍精卵结合，即使完成受精亦可导致流产或死胎。AsAb滴度越高或结合有抗体的精子百分率越高，对生育损害越大。结合于精子头部的AsAb对生育损害较大，结合于尾部的抗体对生育力影响很小。血AsAb与生殖道局部AsAb存在不同步，生殖液中特别是精子表面的AsAb对生育影响很大。

AsAb测定指征：①长期不明原因不育。②有睾丸损伤与炎症、附属性腺感染、附睾和附属性腺及输精管梗阻、输精管再通术后。③精液质量差，存活率低，活动力差。④精液检测有活动精子凝集现象。⑤性交试验异常，活动精子＜5个/HP，或见到摇摆活动的精子。检测标本为夫妇血清和分泌物（精液和宫颈黏液），一般先测血清中抗体，如为阳性，再测分泌物中抗体。AsAb检测意义：免疫性不育辅助诊断；临床疗效考核指标，治疗有效AsAb转阴或滴度下降；病情监测，预后判断。AsAb滴度高、持续时间长往往与疗效差、预后不佳密切相关。

目前已有多种AsAb检测技术，如免疫珠结合试验（免疫珠试验，IBT）、混合抗球蛋白反应试验（MAR）、精子-宫颈黏液接触试验（SCMC）、精子凝集试验、精子制动试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验等，各有优缺点。确诊免疫性不育要在MAR或IBT阳性基础上附加其他试验，附加试验可以是前者的重复试验、精子-宫颈黏液接触试验、精子-宫颈黏液毛细管试验或血清AsAb浓度测定等。

（一）免疫珠结合试验

免疫珠是可与兔（羊）抗人免疫球蛋白共价结合的一类聚丙烯酰胺珠，不同类型的抗体标记不同的颜色，可清晰区别不同类型抗体。精子表面抗体可用直接免疫珠结合试验检测，精浆、血清和宫颈黏液AsAb可用间接免疫珠结合试验检测。IBT敏感性、特异性强，可确定As-Ab类型（IgA、IgG和IgM）和结合部位，WHO推荐为检测AsAb方法。

1．直接免疫珠结合试验 精浆中结合于精子表面的AsAb，可用免疫珠与洗涤精子孵育的方法将其检测出来。将兔（或羊）抗人免疫球蛋白通过共价结合在聚丙烯酰胺微粒（免疫珠）上，通过抗原-抗体反应，将表面结合有抗体的精子与结合有兔（羊）抗人免疫球蛋白的聚丙烯酰胺微粒连接在一起，免疫珠会黏附于表面有抗体的精子上，镜下可见活动的精子带着珠子运动，根据免疫珠标记的不同颜色（如IgA、IgG、IgM分别包被红、蓝、绿色），计数其占活动精子的百分率。本法检测结合在精子表面的抗体，可同时检测IgG、IgA、IgM及抗体存在的部位。试验方法如下：

（1）标本与试剂准备。新鲜精液标本在射精后2h内进行实验，也可对IVF、GIFT或IUI前、优选后精子标本进行检测。活动精子密度＞5×106/ml才能进行直接法检测。储备液使用Tyrode溶液或Dulbecoo磷酸缓冲液（PBS）。缓冲液Ⅰ含5%牛血清白蛋白（BSA）的储备液，加储备液至100ml。缓冲液Ⅱ含0.3%～5%BSA的储备液，加储备液至100ml，或用储备液将缓冲液Ⅰ的BSA浓度由5%稀释至0.3%～5%。

（2）分别向锥底离心管中加入0.2ml 3种储存免疫珠混悬液和10ml缓冲液Ⅱ。根据精子密度和活力确定所需精液量，分别向锥底离心管内加入所需的精液和缓冲液Ⅱ，并充分混匀精液。所需精液见表3-9，或按照使a+b级活动精子密度达到50×106/ml计算所需精液量。500g离心上述离心管5～10min。

（3）精子管。弃上清，重新加入10ml缓冲液Ⅱ混悬精子团，再次离心5～10min，弃上清，用0.2ml缓冲液Ⅰ混悬精子团。

（4）免疫珠管。弃上清，用0.2ml缓冲液Ⅰ混悬免疫珠。

（5）分别取抗IgG、IgA和IgM珠5μl滴在洁净载玻片上，向每个珠滴上加5μl洗过的精子悬液，用加样器头或盖玻片边缘充分混匀，分别盖上盖玻片（20～24mm2），置于37℃湿盒中孵育10～20min。在400～500倍相差显微镜下观察。

2．间接免疫珠结合试验 AsAb可存在体液中，将兔抗人免疫球蛋白通过共价结合在聚丙烯酰胺微粒上，用供精者精子作抗原，如果待测血清、精浆或宫颈黏液中存在AsAb，通过抗原抗体反应，精子表面结合的抗体与聚丙烯酰胺微粒上的免疫球蛋白（免疫珠）连接在一起，镜下可见活动精子带动不同颜色的珠子运动，计数其占活动精子的百分率。间接免疫珠实验用于检测血清、精浆及宫颈黏液的AsAb，可同时检测IgG、IgA和IgM抗体及抗体存在部位。试验方法如下：

（1）标本准备。标本用正常供精者精液，待测血清或精浆或宫颈黏液。精液：正常供精者的精液，经实验证实无精子表面和精浆AsAb存在。血清：静脉取血，将凝固血1000g离心15min，将上层血清吸到一洁净有盖的血清瓶中，56℃水浴30min灭活补体，-70℃冷冻待测。精浆：将至少200μl精液加入到1.5ml带盖的Eppendorf管中，1000g离心15min，将上层悬液吸至一有盖洁净管中，56℃水浴30min灭活补体，-70℃冷冻待测。宫颈黏液：吸取适量宫颈黏液至1.5ml的Eppendorf管中，加入等量的含10U/ml菠萝蛋白酶的PBS。

（2）分别向锥底离心管中加入0.2ml 3种储存免疫珠混悬液和10ml缓冲液Ⅱ。500g离心5～10min，弃上清，向管中加入0.2ml缓冲液Ⅰ混匀待用。

（3）正常供精者试验前取精液，液化后做精液常规，计数活动精子密度，按直接免疫珠方法步骤（2）（3）所述，用缓冲液Ⅱ将正常供精者精子洗涤2遍。然后用缓冲液Ⅰ调整洗后的精子悬液a+b级活动精子密度，使其达到50×106/ml待用。

（4）用40μl缓冲液Ⅰ稀释10μl待检标本，稀释后加入到锥底离心管中，再加入50μl洗涤后调整好活动精子密度的精子，混匀后盖上盖子，37℃孵育1h。向离心管中加入10ml缓冲液Ⅱ混匀，500g离心5～10min，弃上清，重复上步，弃上清，向管中加入50μl缓冲液Ⅰ混匀。

（5）分别取抗IgG、IgA和IgM珠5μl滴在洁净载玻片上，向每个珠滴上加5μl待检标本和精子的混悬液，用加样器头或盖片边缘充分混匀，分别盖上盖玻片（20～24mm2），并将其置于37℃湿盒中孵育10～20min。在400～500倍相差显微镜下观察结果。

3．结果判断 分别记录带珠的活动精子百分率（忽略尾尖结合）。每片计数2次，每次计数至少200个活动精子。记录免疫珠类型（IgG、IgA和IgM）以及免疫珠同精子结合部位（头、中段、尾）。活动精子结合免疫珠＜20%为阴性，20%～50%为阳性，＞50%为强阳性。

4．临床意义 如有50%或更多活动精子（前向运动或非前向运动）上包裹着免疫珠，该试验具有临床意义，此时AsAb会对精子穿透宫颈黏液的能力和体内受精过程造成损害。如果精子结合仅限于尾尖则与生育力减轻无关，无临床意义。头部结合免疫珠对不育意义最大，这可能与精子头在受精过程中的重要作用、与AsAb影响生育的机制有关。

（二）混合抗球蛋白反应试验

MAR亦称混合凝集试验，是用包被了人IgA或IgG的乳胶颗粒或红细胞与待测的新鲜精液混合后，加入抗免疫球蛋白血清。如果游动的精子表面结合有抗精子抗体时，则精子与包被了人IgA或IgG的乳胶颗粒或红细胞结合形成可动的混合凝集团，反之，乳胶颗粒则相互粘着成团。本试验用于检测精子表面结合的抗精子抗体（直接法），也可检测血清和生殖道分泌液中的抗精子抗体（间接法）。

1．试验方法

（1）标本准备。包被了人IgA或IgG的乳胶颗粒或红细胞、抗人IgA或IgG抗血清可购得。新鲜精液不做处理，液化后检测。待测血清或生殖道分泌液经56℃30min灭活。

（2）直接法。在一洁净载玻片上滴加10μl新鲜待检精液和10μl包被了人IgA或IgG的乳胶颗粒或红细胞，用盖玻片充分混均，再加10μl抗人IgA或IgG抗血清，再用盖玻片充分混均，盖上盖玻片，2～3min后在400倍或600倍亮视野或相差显微镜下观察湿片，10min后再观察一次。

（3）间接法。灭活后的血清或生殖道分泌液5ml加培养液（如RPMI 1460）35μl于小试管中，加新鲜液化正常人精液40ml混均，37℃1h。取上述保温后混合物10μl于载玻片上，再按直接法方法加乳胶颗粒和抗血清，并镜检。

2．结果判断 没有包被抗体的精子可在乳胶颗粒之间自由游动，而乳胶颗粒自已相互粘成一团。如果精子表面有抗体则乳胶颗粒会与精子相互粘附，开始时活动精子可带动少数几个或成串的粘附颗粒移动，最后凝集成团变得很大，以致精子活动严重受限。至少应计数200个活动精子，计算粘附乳胶颗粒活动精子的百分率。

3．临床意义 当粘附乳胶颗粒的活动精子百分率≥50%结果为阳性，10%～50%可疑阳性。

4．注意事项 每次实验应设阳性、阴性对照。

（三）精子-宫颈黏液接触试验

精子-宫颈黏液接触试验以精子作为抗原，利用抗原抗体反应原理，体外检测精子表面和宫颈黏液是否存在抗精子抗体，试验结果也可提示AsAb抑制精子穿透和移动程度。

1．试验方法 射精1h内的新鲜精液、月经中期（排卵前）宫颈黏液。将少量（10～15μl）排卵前宫颈黏液和相似量的新鲜精液置于载玻片的一端，将两者充分混匀，用盖玻片盖上。将同一精液标本再滴1滴于玻片的另一端，用盖玻片盖上。将玻片置于湿盒中室温30min。在400倍镜下观察。

2．结果判断 计数迅速摆动的活动精子百分数。单纯精液滴作为精子活力对照。不活动及摆动缓慢的精子不算。缓慢向前移动或间歇向前运动的精子应属于摆动精子范围。摆动精子百分率为0%～25%为阴性，26%～50%为弱阳性，51%～75%为阳性，76%～100%为强阳性。

3．临床意义 摆动精子百分率高表明大部分精子不能通过宫颈黏液，精子很难达到卵母细胞。SCMC试验为阳性或强阳性时，应用供精者精液和供者宫颈黏液与试验阳性的精液和宫颈黏液分别进行交叉试验，以确定抗体是在精液，还是在宫颈黏液。大部分患者，摆动精子百分率高是由于精子上有AsAb，偶见宫颈黏液存在AsAb。SCMC试验计数应记录不动精子百分数，目的是将精子不动的其他原因与“摆动”现象相区别，这些原因包括精子表面或宫颈黏液中存在特异性的、补体依赖性的精子毒素抗体，或更常见的酸性宫颈黏液对精子的直接影响。

4．注意事项 宫颈黏液采集的时机对本试验的结果有直接影响。月经中期排卵前的宫颈黏液易于精子穿透。酸性黏液可使精子制动，碱性黏液可使精子活力增强，适合精子泳动与存活的最佳pH为7.0～8.5，这也是月经中期宫颈黏液正常的pH值范围。

（四）精子凝集试验与精子制动试验

精子凝集试验是通过检测标本如有AsAb则与精子表面抗原相互作用，产生凝集而检测AsAb的一种试验。根据使用反应器皿分为浅盘凝集试验（TAT）、明胶凝集试验（GAT）、毛细管凝集试验（CTAT）、玻片凝集试验（SAT）、试管玻片凝集试验（TSAT）等多种方法。本节选择浅盘凝集试验进行说明。精子制动试验（浅盘精子制动试验，SIT）是通过检测标本如有AsAb则与精子表面抗原相互作用，加入外源性补体，直接破坏精子顶体和中段细胞膜的完整性和通透性，造成精子活动力丧失直至死亡。此法依赖补体系统，以细胞毒形式发挥作用，又称补体依赖法精子制动试验、细胞毒法精子制动试验。以上2种试验均可检测血清、精浆与宫颈黏液中的AsAb。检测抗体类型为IgG、IgM。

1．试验方法

（1）标本准备。血清：静脉取血，凝固后1000g离心15min，吸上层血清至一洁净有盖血清瓶中，56℃水浴30min灭活补体，-70℃冷冻保存待测。精浆：将精液标本1000g离心5～10min，收集上清。宫颈黏液：取自月经中期排卵前的宫颈黏液放入0.5ml的PBS（磷酸缓冲液）中，置4℃24h，然后用25号针头注射器反复抽吸以液化黏液，以1000g离心5～10min，收集上清，待测标本置于-20℃，测定前56℃水浴30min灭活补体，稀释成不同滴度。

（2）高活力正常精子制备。取液化后的正常精液0.5ml置于玻璃试管中，沿管壁加入含5%BSA的Tyrode液1ml，倾斜置于37℃10min，吸取试管下层的培养液，使其活力＞80%，密度为40×106/ml。

（3）将微量测定盘用75%乙醇洗净，晾干，将2ml液体石蜡加到微盘中，使液体石蜡均匀覆盖盘面。微盘第1排为凝集试验，第2排为制动试验对照组，第3排为制动试验实验组。用0.01mol/L的PBS稀释待测标本至1∶4。用PBS清洗微量加样器4次，清洗后用此加样器分别加2μl经1∶4稀释的待测标本，或一定稀释度的已知阴性、阳性血清于每纵行各环内。加1μl高活力精子于各环，加1μl灭活补体于第2排各环，加1μl补体于第3排各环。用针头将各环血清、精子、补体混匀，置室温下（20～24℃）2～4h，显微镜下观察精子凝集程度与类型。

2．结果判断

（1）精子凝集试验。显微镜下观察活动精子凝集情况，凝集精子数＞50%为凝集阳性，同时判断凝集类型（头-头、头-尾、尾-尾、混合型）。有的认为有凝集成团并且活动的精子时，可判定为阳性反应，只有活动的凝集精子才能判断为阳性，不活动的精子因不易与非特异性粘着或堆集的精子区别，不应计入。也有按凝集滴度测定，凝集滴度在1∶8以上视为阳性。此试验所用精液少，1份可检测许多血清样本，操作迅速，可观察精子凝集部位，可出现非AsAb引起的精子凝集反应假阳性结果。

（2）精子制动试验。显微镜（400倍）观察，观察时与对照环作比较，计数200条精子中活动精子，算出精子活率。精子制动值（SIV）=对照环精子活动数/实验环精子活动数，以SIV≥2.0为精子制动试验阳性，＜2.0为阴性。

（3）注意事项。可疑阳性应重复试验，以免误判。每板均应设阳性与阴性对照。结果阳性时，应采用0.01mol/L的PBS对待测标本作系列稀释至1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64……观察其抗体效价。

（五）酶联免疫吸附试验

ELISA检测AsAb是用正常生育者精子直接或制成包被抗原来包被酶标板，将精子抗原吸附在聚苯乙烯固相载体表面，使免疫反应在载体上进行，通过化学方法将酶与抗人免疫球蛋白结合，该酶标记物仍保持其酶活性和免疫活性，然后它与待测标本和精子抗原形成的抗原抗体复合物中的抗体发生反应，形成抗原-抗体-酶结合物免疫复合物。结合在免疫复合物上的酶在遇到底物时，催化其水解、氧化还原反应，使生成有色产物，酶降解底物的量与呈现的色泽浓度成正比，由此可以反映被测抗体的量。利用酶联免疫吸附试验原理可检测血清、精浆或宫颈黏液中的AsAb。

1．试验方法

（1）标本与试剂。血清：静脉抽血，分离血清，保存-20℃待测。精浆：精液完全液化后1000g离心10min，收集上清，-20℃保存待测。宫颈黏液：月经中期排卵前宫颈黏液加入0.5 ml生理盐水，-20℃保存待测。标本检测前均需56℃水浴30min灭活补体。缓冲液：0.01 mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲生理盐水（TBS）。洗涤液：TBS-0.05%吐温-20溶液。酶结合物：辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗人IgG（HRP-羊抗人IgG）。终止液：3M NaOH。抗原提取液：NP-400.5ml、Tris 0.61g、EDTA 0.12g、NaCl 0.79g，蒸馏水溶解后调节pH至8.5，加蒸馏水至1000ml。

（2）精子抗原制备。将正常精子用0.01mol/L TBS反复洗涤，尽可能去除精浆。向精子沉淀中加入抗原提取液于4℃搅拌提取1h。高速离心30min去沉淀，上清即为精子抗原，测定上清液蛋白浓度，并用0.01mol/L TBS将蛋白浓度稀释为7～140g/ml。

（3）抗原包被。在聚苯乙烯或聚氯乙烯微量测定板上，每孔加入精子抗原溶液100μl（2～5μg/ml）,4℃过夜。

（4）次日晨弃去抗原溶液，用TBS-T洗涤3次，每次5min，每次洗涤后用力将反应板孔中的液体甩干并在滤纸或纱布上用力拍干。测定板可立即使用，也可自然干燥后保存在-70℃冰箱备用。

（5）酶标板封闭。向已包被的微孔板各孔加入100μl含0.05%吐温-20的TBS，室温静置1h。同上洗涤3次。

（6）将待测标本用标本稀释液（含2%牛血清清蛋白的TBS）稀释，分别加入100μl阴、阳性对照及稀释后的标本，空白对照孔加入100μl稀释液。37℃孵育60min，用TBS-T洗涤3次，每次5min。拍干后每孔加入2滴酶结合物。37℃孵育60min，用TBS-T洗涤3次，每次5min。拍干后加入新鲜配置的底物溶液100μl，混匀后避光反应10min。加终止液1滴，混匀后用酶联检测仪检测。

2．结果判断 以空白孔调零，450nm测吸光度值，标本吸光度值与阴性对照吸光度值之比≥2.1为阳性。目测阴性不显色，阳性为明显黄色。

3．临床意义 ELISA检测AsAb简便易行，敏感性好，可用于大量标本的筛查，能检出各种免疫球蛋白亚类抗体。特异性差，有假阳性，主要原因是精子表面有Fc受体存在，精子表面抗原与体内其他组织抗原有交叉反应性，抗体亲和力低或在固定时精子抗原发生了改变，精浆中存在大量碱性磷酸酶对测定有干扰。精浆和宫颈黏液中AsAb主要为AsAb-IgG和AsAb IgA，应同时检测这2种类别AsAb。

4．注意事项 每次测定均应设已知阴、阳性对照。洗涤时最好能将反应板在振荡器上振匀；倾倒时要完全、迅速，并用力在滤纸上拍干净。

（六）间接免疫荧光试验

将待检标本加至固定有精子抗原的玻片上温育，如待检标本中含AsAb则与精子抗原发生抗原抗体反应，然后加入荧光素标记的抗免疫球蛋白并发生反应，形成抗原-抗体-荧光素标记的抗免疫球蛋白复合物。该复合物可在荧光显微镜下观察到，精子膜呈现荧光则示有AsAb。可检测血清、精浆及宫颈黏液中的AsAb。

1．试验方法 正常有生育能力的男性精液液化后用PBS（0.01mol/L pH7.2）洗涤3次，500g离心10min，弃上清。用PBS混悬，调整精子浓度为50×106/ml。吸1滴精子悬液制备精子涂片，室温自然干燥。甲醇（AR级）固定10min。将稀释的待检血清加至精子涂片上，37℃湿盒内孵育30min。洗去玻片上的血清，PBS浸洗3次，每次3min。加入经预试验确定了最适稀释度的异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG或IgM,37℃湿盒内孵育30min。自来水冲洗、晾干，以10%甘油PBS封固，荧光显微镜下观察结果。

2．结果判断 荧光显微镜下观察，AsAb阳性者可见精子头部、中段呈现荧光。将精子呈现的特异荧光强度分为4级：无荧光、微弱荧光、明亮荧光及闪亮荧光。明亮荧光及闪亮荧光判断为阳性，仅有微弱荧光不记作阳性。

3．临床意义 此法检出的抗体以IgG和IgM为主。可用于抗体种类的辨别及抗原定位。正常生育夫妇效价≤1∶16, ≥1∶32为阳性。

二、精浆免疫抑制物测定

精浆含有多种免疫抑制活性物质，随精子进入女性生殖道后，对生殖道局部和全身免疫起抑制作用，使精子及受精卵免遭免疫系统排斥，保障受精卵着床发育，使正常生殖过程得以顺利完成。精浆免疫抑制物活性是多种物质的综合反映，精浆免疫抑制物作用主要体现在对T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、补体系统等的抑制作用，此外还可抑制某些抗体对某些细菌的杀菌活性。男性抑制物（MIM）和人精浆免疫抑制因子-DF2均为从精浆中提取出来的某种成分。研究发现，男性抑制物可对T、B、NK、巨噬细胞和多形核白细胞产生抑制作用，缺乏时可引起妻子对丈夫精子的过敏反应，产生AsAb，引起不孕。人精浆免疫抑制因子-DF2可对外周血NK细胞活性和外周血淋巴细胞转化试验产生明显的抑制作用。目前已有多种方法用于人精浆免疫抑制物的测定，包括抗补体法检测精浆免疫抑制物活性、单项免疫扩散法检测男性抑制物、间接免疫荧光定位分析精子表面男性抑制物、固相酶联免疫法测定人精浆免疫抑制因子-DF2等。本节主要介绍抗补体法检测精浆免疫抑制物活性。

（一）抗补体法检测精浆免疫抑制物活性

将待测精浆与补体混合，用致敏羊红细胞为指示系统，与精浆空白对照比较，观察引起50%溶血的补体用量。

1．检测方法

（1）试验试剂。缓冲等渗生理盐水：NaCl 17.5g、Na2HPO41.13g、KH2PO40.27g，加生理盐水至100ml，用时取5ml加蒸馏水95ml、100g/L MgSO40.1ml。溶血素：兔抗羊红细胞抗体，用1∶100稀释的豚鼠血清作为补体。2%绵羊红细胞（SRBC）：用全血细胞保养液保存于4℃,2周内使用，用时以缓冲等渗盐水洗3次，配成2% SRBC悬液。1%致敏SRBC:2% SRBC悬液加等量最适浓度溶血素，37℃水浴15min。补体：新分离的豚鼠血清分装每管0.1ml, -30℃保存，用时以缓冲盐水1:100稀释，或用豚鼠的冻干血清。50%溶血标准管：1% SRBC 0.4ml加蒸馏水0.6ml，使全溶后取0.5ml加缓冲盐水0.5ml。

（2）试验步骤。试验管和对照管共2排，每排6管，2排管内依次加入不同量的1∶100稀释的豚鼠血清0.05ml、0.10ml、0.15ml、0.20ml、0.25ml、0.30ml，向6支试管内依次加入经离心处理后不同稀释度的精浆，即分别将0.05ml精浆与0.5ml、0.45ml、0.40ml、0.35ml、0.30ml、0.25ml的缓冲盐混合构成稀释倍数分别为11、10、9、8、7、6、5的精浆，向6支对照管内加入0.05ml的盐水。37℃水浴15min，每管加致敏SRBC 0.4ml,37℃水浴30min。各管250g离心5min，与50%溶血标准管目视比色，观察引起50%溶血的补体用量。

2．结果判断 人精浆免疫抑制物活性=50%溶血试验管补体量（ml）/50%溶血对照管补体量（ml）×精浆稀释倍数。现提供两个实验室正常参考值：（430±62）U/ml、360U/ml，各实验室应建立自己的正常参考值。

3．临床意义 精浆免疫抑制物对补体有明显的抑制作用，这种作用有助于保护精子免遭抗体参与的补体介导的溶细胞反应。

（二）其他方法

1．单向免疫扩散法检测男性抑制物 将抗MIM抗血清与融化的琼脂混匀、浇板、打孔，再加入待测精浆。精浆中MIM向含抗MIM血清的琼脂板中扩散，与抗MIM结合形成肉眼可见的白色沉淀环。沉淀环直径与精浆中MIM含量呈正相关。再根据标准曲线可计算出精浆MIM含量。

2．间接免疫荧光定位分析精子表面男性抑制物 精子表面男性抑制物可与兔抗人MIM抗体结合，再加入荧光标记的二抗（羊抗兔IgG-FITC），在荧光显微镜下观察，含精子表面男性抑制物的精子体表着染浓厚的荧光斑点，定位于精子头部、颈部和尾部。

3．固相酶联免疫法测定人精浆免疫抑制因子-DF2用兔抗人DF2抗体包被聚氯乙烯反应板，加入待测精浆。精浆中的DF2会与之结合。洗板后再加入HRP-抗人DF2抗体，洗涤后显色。根据标准曲线可计算出DF2含量。

三、抗胰岛素抗体检测

多年患糖尿病者约有50%患者不育，这与糖尿病影响内分泌、精液质量以及神经元病变引起阴茎勃起功能障碍和逆行射精有关外，一些患者，尤其是胰岛素依赖性糖尿病患者血中常可测出抗胰岛素抗体，可能是不育原因之一。在此介绍酶联免疫吸附试验检测抗胰岛素抗体方法。用纯化的人、猪或牛胰岛素为抗原包被固相载体，与待测血清中的抗胰岛素抗体结合，形成抗原-抗体复合物，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG反应，加入酶底物显色液，根据显色的深浅判断抗胰岛素抗体的存在。

（一）检测方法

1．标本与试剂 静脉取血，离心取血清，-20℃保存。有试剂盒出售。胰岛素抗原为纯化的人、猪或牛胰岛素，抗体为辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG或葡萄球菌A蛋白（SPA）。稀释液（PBST）:0.01mol/L pH7.4的PBS-吐温-20磷酸盐缓冲溶液，临用前加小牛血清使其浓度达10%。洗涤液：0.02mol/L pH7.4 Tris HCl吐温-20。酶底物显色液（OPD-H2O2）：邻苯二胺（OPD）4mg加5.14ml 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O，再加0.1mol/L枸橼酸4.86ml，加入3% H2O250μl，用前配制。终止液：2mol/L的H2SO4。

2．酶标板包被 按试验盒要求将一定量的包被液加入胰岛素抗原中混匀。向聚苯乙烯反应板内加入抗原包被液，每孔100μl,4℃过夜，自然干燥，用PBST洗涤3次，每次3min。

3．封闭、显色 用含15%小牛血清的PBST封闭，每孔100μl,45℃1h, PBST洗涤。每孔加稀释液100μl，待检血清5μl或阳性、阴性对照各5μl,45℃30min, PBST洗涤。每孔加入酶底物显色液100μl，室温3～5min，用终止液每孔50μl终止反应。

（二）结果判断

酶标仪492nm测吸光度值。检测标本吸光度值与阴性对照的吸光度值之比值≥2.1为阳性。

第三节 内分泌检查

一、内分泌激素测定

睾丸活动虽不出现明显周期性，但受下丘脑-垂体-睾丸轴调控，分泌促性腺激素释放激素、促性腺激素、性激素（雄激素、雌激素），它们之间存在分泌调节与反馈调节。GnRH外周血很难测出，可通过测定外周血促性腺激素水平来反映。男性不育症诊治时主要检测促卵泡素、黄体生成素、雄激素（主要测睾酮）、雌激素（主要测雌二醇）、泌乳素等项。此外，人绒毛膜促性腺激素、肾上腺皮质激素、甲状腺激素、胰岛素等与男性生殖有一定的关系，应根据患者具体情况选择应检测激素。男性激素测定的目的是寻找不育症的病因，了解与评价治疗效果。检测方法与女性激素测定相同（见第二章第二节），本部分主要介绍激素测定的意义。

（一）雄激素

睾丸分泌最主要的雄激素为睾酮，其他为雄烯二酮、脱氢表雄酮、双氢睾酮等。在LH作用下，睾丸间质细胞将胆固醇合成睾酮，血清睾酮95%由睾丸产生，少量由肾上腺分泌。男性雄激素（主要是睾酮）主要功能是促进并维持男性第二性征发育，促进精子发生和成熟，维持男性性功能，促进蛋白质合成及骨骼生长等。睾酮增高见于睾丸间质细胞瘤、先天性肾上腺皮质增生与肾上腺男性化肿瘤、男性多毛症、男性性早熟等。睾酮减低见于原发性睾丸发育不全、类无睾综合征、下丘脑或垂体性性腺功能减退、睾丸功能低下与睾丸缺失等。判断测定结果时要注意昼夜变化对睾酮的影响，早晨睾酮血清浓度比夜间睾酮浓度高20%～40%。短时间剧烈运动可使血清睾酮浓度增高，长时间运动睾酮浓度下降。几乎所有慢性病，特别是肝脏、肾脏和心血管疾病，甲减与甲亢，以及应激、麻醉、毒品和药物（如酮康唑）可降低睾酮。成年男子上午血清睾酮浓度正常值为12～40nmol/L（3.5～11.5ng/ml），低于10nmol/L（2.9 ng/ml）肯定为病理性，介于10～12nmol/L（2.9～3.5ng/ml）应进一步检测。青春期前低于4nmol/L（1.2ng/ml）。世界卫生组织正常参考值13～33nmol/L（3.8～9.5ng/ml）。

（二）雌激素

男性少量雌激素由睾丸分泌，睾酮经芳香化可以转变为雌二醇和雌酮。青年男性循环中仅10%～25%的雌二醇直接在睾丸合成，其余均来自周围芳香化。雌激素生理作用有认为可刺激睾酮产生，也有认为可抑制睾酮产生。雌二醇增高见于雌激素分泌瘤、男性女性化，是男性睾丸肿瘤诊断指标之一，肥胖男子血E2水平较高，男性吸烟者血E2水平明显高于非吸烟者。正常参考值为50～200pmol/L（13.6～54.4pg/ml）。世界卫生组织正常参考值70～190pmol/L（19～51.7pg/ml）。

（三）促卵泡素

FSH可作用于支持细胞，刺激支持细胞促使精子发生，刺激精曲小管发育，与睾酮一起促进精子的产生与发育。FSH与支持细胞上受体结合，影响细胞的能量代谢、蛋白合成与细胞分裂，产生雄激素结合蛋白与间质细胞刺激因子，这些均与精子产生有关。雄激素结合蛋白与睾酮结合后被转运至精曲小管管腔内，维持管腔内睾酮高浓度，促进生精过程，特别是促进减数分裂，还可在支持细胞内使睾酮经芳香化酶作用转变为雌二醇，使男性体内有少量的雌激素。FSH升高见于高促性腺激素型性功能低下，若FSH和LH增高，T水平低下、T/LH比值降低，提示高促性腺激素型性功能低下系原发性睾丸功能衰竭，如Klinefelter综合征，精索静脉曲张、放射线和药物引起的无精子症。FSH下降可见于男性性功能低下及青春期延迟。当FSH、LH、T均为低下水平，睾丸容积缩小、精液质量极差甚至无精子症，可诊断为低促性腺激素型性腺功能低下症，提示下丘脑-垂体功能减低所致的继发性睾丸功能低下，常有后天性垂体、下丘脑损伤或病变。FSH、LH、T、E2正常或升高，性分化异常，女性化，提示睾酮受体缺乏或结构异常致睾丸女性化。FSH、LH、T、E2正常，性分化异常，双氢睾酮明显下降，4β/5α类固醇比值升高，睾酮/双氢睾酮比值升高，提示5α-还原酶缺陷。WHO参考值为1.2～5U/L。

（四）促黄体生成素

LH能促使睾丸间质细胞增殖并合成雄激素，协同FSH促进精子成熟。LH在睾丸生精功能损害时反应明显低于FSH。LH一般同FSH联合测定，二者测定是判断下丘脑-垂体-性腺功能的常规检查方法。临床意义可参见促卵泡素。世界卫生组织参考值为2.5～9.8U/L。

（五）泌乳素

在睾酮存在条件下，PRL促进男性前列腺及精囊发育，增强LH对Leydig细胞的作用，使睾酮合成增加。PRL还参与调节肾上腺生成雄激素、参与应激反应等作用。青春期下丘脑综合征、垂体增生、垂体肿瘤、原发性甲状腺功能减退、肾上腺功能减退、原发性性功能减退、男性乳房发育征等PRL增高。垂体前叶功能减退，如席汉综合征、垂体嫌色细胞瘤等PRL减少。部分药物如降钙素、左旋多巴、去甲肾上腺素等可直接或间接抑制PRL分泌与释放，血PRL浓度下降。正常男性PRL基础值一般＜20ng/ml，世界卫生组织参考值为110～510mU/L。

（六）抑制素B

男性主要产生抑制素B（INHB），抑制素A极少或无。INHB青春期前主要由睾丸未成熟支持细胞产生，青春期后由支持细胞和间质细胞产生，可以直接反映睾丸功能。男性INHB变化主要与年龄有关。出生后抑制素就开始升高，1岁以前就达到成人水平峰值，然后很快下降。青春期开始后，INHB开始迅速升高，在20多岁时达到另一个峰值，然后随年龄缓慢下降。INHB水平反映整个睾丸组织功能，精子发生中成熟的生精细胞刺激其分泌，与之相比，FSH水平同时还要受GnRH、E2、T的影响。因此INHB是目前已知评价不育男性精子发生最好的内分泌标志物，在区分正常和受损的精子发生时，INHB测定甚至可以取代睾丸活检。测定不育男性血INHB水平可以了解男性不育症患者生精功能。正常男性INHB平均值为181.9 pg/ml，梗阻性无精子症患者为224.0pg/ml，重度少精子症患者为128.9pg/ml，原发性无精子症患者平均水平为52.0pg/ml。无睾症INHB检测不到，隐睾症正常或轻度降低，可以鉴别无睾症和隐睾症，帮助诊断性早熟。血清INHB水平是预测无精子症患者TESE结果的指标，INHB＞40pg/ml TESE成功敏感性90%，特异性100%。

（七）肾上腺皮质激素与促肾上腺皮质激素

参见第二章第二节“肾上腺皮质激素与促肾上腺皮质激素”。

（八）甲状腺激素与促甲状腺素

甲亢或甲减患者往往出现性欲与性功能低下、生精功能障碍，导致精液质量下降，引起男性不育，应注意甲状腺激素测定。参见第二章第二节“甲状腺激素与促甲状腺素测定”。

（九）胰岛素

糖尿病患者由于葡萄糖利用障碍也可见性功能和生精功能减退，应注意胰岛素测定。参见第二章第二节“胰岛素测定”。

二、内分泌功能试验

生殖激素基础值测定为生殖内分泌疾病的诊断提供了诊断依据，但有些疾病难以鉴别，不能确切评价下丘脑-垂体-睾丸性腺轴各水平的功能储备状态。激素刺激试验能帮助性腺轴定位诊断。本节介绍克罗米酚试验和人绒毛膜促性腺激素试验。其他试验，如促性腺激素释放激素刺激试验、地塞米松抑制试验、泌乳素分泌试验、促肾上腺皮质激素兴奋试验、促肾上腺皮质激素释放激素刺激试验、促甲状腺激素释放激素兴奋试验见第二章第二节“内分泌检查”。

（一）克罗米酚试验

克罗米酚化学结构与人工合成的乙烯雌酚很相似，作用机制是与雌激素竞争下丘脑或垂体腺细胞浆内的雌激素受体，阻断雌激素对下丘脑、垂体的反馈作用，引起GnRH分泌增加，从而增加垂体促性腺激素释放，睾酮水平上升。克罗米酚主要在下丘脑水平起作用，而不是在垂体水平，克罗米酚刺激试验可以鉴别下丘脑功能异常与垂体前叶功能衰竭。但许多试验证明，此试验并不能起到区别下丘脑与垂体病变的作用，如Kallmann综合征（下丘脑病变）和垂体病变对此试验均无反应。实际上本试验只是下丘脑-垂体储备试验。如能直接测定血GnRH含量，此试验有可能成为鉴别下丘脑和垂体病变的重要试验。目前此试验用于对低促性腺激素型性功能低下症和对青春发育期的估价，可进一步判断性腺功能低下是原发性还是继发性。

1．试验方法 全过程需12d，服药前2d先测血清FSH、LH、T基础值，第3d起连续服克罗米酚10d，每日200mg，服药第9d、10d分别采血测FSH、LH、T浓度。

2．结果判断 正常成年男性服药后，LH较基础值增高72%～245%, FSH增高45%～130%, T增高22%～40%。

3．临床意义 低促性腺激素型性功能低下症（包括Kallmann综合征）、单纯青春期发育迟缓和青春期无发育者，试验结果无增高反应。青春期发育迟缓者对第1次刺激试验可能无反应，与特发性低促性腺激素型性功能低下的反应有明显交叉重叠现象，两者难以区别。性腺功能低下者，若对本试验及GnRH兴奋试验均无反应或仅有弱反应，提示病变发生在垂体；若本试验无反应或仅有弱反应，而GnRH兴奋试验反应正常或呈延迟反应，表明病变在下丘脑。

（二）人绒毛膜促性腺激素刺激试验

HCG的结构和生理效应与LH相似，能刺激睾丸间质细胞合成与分泌睾酮，用HCG刺激睾酮分泌的反应程度可反映睾丸间质细胞的功能状态与储备功能。

1．试验方法 试验日上午8～9时肌注HCG 4000～5000U，分别于注射前（基础值）、注射后24、48和72h采血测睾酮。每次采血均在上午8～9时进行。

2．结果判断 正常男性睾酮反应的高峰多数出现在48或72h，最大分泌反应比基础值增加2倍以上（或20nmol/L,5.6ng/ml）。分析时应注意基础值的高低与注射HCG后反应值大小的综合分析比较。HCG刺激试验结果判断参考见表3-10。

3．临床意义 ①睾酮浓度在去势范围，刺激后无增高，提示无睾症、睾丸间质细胞不发育、睾丸组织完全萎缩及睾酮合成酶缺陷。②反应低下或反应迟钝，提示性腺机能减退，如双侧隐睾者，治疗1～2周可能出现反应；克氏综合征有不同程度的反应，但一般均低于正常人；男性真或假两性畸形者可无反应或不同程度反应，起反应程度取决于Leydig细胞功能状态和有无睾丸组织；体质性青春期延迟反应较IHH患者好，处于青春期启动的青少年可达正常成人水平；选择性促性腺激素缺乏（IGD）与IHH患者无反应、低下或迟缓反应，常规治疗1～2个月后部分患者可能出现正常反应，但少数患者（下丘脑与睾丸双重缺乏）仍反应很差；先天性睾酮合成酶缺陷者无反应。

第四节 遗传学检查

因遗传物质改变而引起的疾病为遗传病。遗传物质包括细胞中的染色体、染色体上的基因或DNA。遗传病可分为单基因病、多基因病、染色体病和体细胞遗传病。体细胞遗传病如不涉及生殖细胞遗传物质的改变，一般不会向后代传递，如某些肿瘤和先天畸形。许多生殖系统疾病的发生可归因于遗传物质的改变，属于遗传病范畴，需要通过遗传学方法协助临床诊断。当有下列情况者，应进行遗传学检查，明确病因：①家庭成员有多个先天畸形者。②先天畸形，特别是男女内外生殖器畸形者。③第二性征发育异常者。④无精子症，严重的少、弱、畸形精子症。⑤复发性流产或不良生育史夫妇。⑥明显有某些遗传病的症状及体征者。⑦症状和体征疑为先天愚型的小儿及其双亲。⑧卵巢性闭经及不育症。

一、细胞遗传学检查

（一）性染色质检查

性染色质有X染色质与Y染色质，分别与X染色体与Y染色体相关。人的性别由X和Y染色体决定。性染色质检查主要用于两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断或产前诊断。性染色质检查材料可用发根鞘细胞、皮肤或口腔上皮细胞、血细胞、阴道上皮细胞，或取自绒毛和羊水胎儿脱落细胞等。

1．X染色质检查

（1）检查方法。用压舌板刮取口腔颊部黏膜涂在玻片上，立即放入固定液（95%乙醇与乙醚之比为1∶1），至少固定1.5h；浸入纯乙醇1～3min，浸入0.25%火棉胶乙醇乙醚溶液15～20s，空气中干燥15s，浸入70%乙醇1～3min，浸入50%乙醇1～3min，蒸馏水冲洗2次共5min，在1mol/L盐酸液中、56℃下水解5min，流水冲洗，硫黄液中染色10～20min，冲洗染片，干燥后镜检。40倍光学显微镜或油镜检查100个可计数细胞，计数有X染色质的细胞数。

（2）结果判断。镜下正常女性体细胞间期细胞核中可见1～1.5μm大小位于核膜内缘的浓染小体，可呈平凸形、圆形、半圆、扁平形、三角形等，呈异固缩状态。口腔黏膜上皮X染色质数平均在20%以上，女胎绒毛细胞X染色质数平均在30%以上，女胎羊水细胞X染色质数平均在10%以上。正常男性个体无X染色质。X小体出现频率男性表型者＞1%～2%或女性表型者＜20%时应重复检查，必要时作染色体核型分析。一般染色体结构异常时X染色质形态可发生改变。

2．Y染色质检查

（1）检查方法。以压舌板刮取口腔黏膜涂在玻片上，立即放入固定液（95%乙醇与乙醚之比为1∶1）中固定15min～12h，再浸入95%乙醇中30min，空气中干燥，以0.005%芥子喹吖因染色10min，蒸馏水中分色10min并封片，荧光显微镜镜检，观察100个细胞核。

（2）结果判断。荧光显微镜下正常男性体细胞间期细胞核中可见到一个直径0.25～0.3 μm强荧光小体，呈特别明亮的黄绿色荧光点，即Y染色质，见于细胞核内任何部位，中央多见，出现频率30%～80%。间期细胞核Y染色质数反映分裂期细胞核Y染色体数，即受检者Y染色体数。正常女性间期细胞核中不存在Y小体。Y染色质取材以外周血涂片为好，常检测淋巴细胞Y染色质。口颊黏膜细胞易受杂质干扰而不准确。若Y小体检测用培养后的淋巴细胞为标本，观察到的Y小体亮点大而清晰。

（二）染色体核型分析

细胞有丝分裂中期染色体形态结构最典型，常以中期染色体作为观察、分析的标准。一个体细胞中的全部染色体，按照规定体制（Denver体制）排列起来构成的图像称为核型，对其进行分析确定是否与正常核型一致的过程称为染色体核型分析。

1．染色体标本制备 染色体检查材料可用发根鞘细胞、皮肤或口腔上皮细胞、血细胞、阴道上皮细胞，或取自绒毛和羊水胎儿脱落细胞等。以外周血淋巴细胞制备染色体标本较好。人精子染色体自然畸变率明显高于外周血染色体畸变率，外周血染色体反映的变异或畸形情况并不完全代表配子染色体变异或畸变情况。直接分析精子染色体对了解不孕不育原因有一定意义。

（1）外周血淋巴细胞培养染色体标本制备。

1）试剂。培养液：RPMI 1640 4ml、小牛血清1ml、植物血凝素工作液（PHA，浓度1%～2%，生理盐水稀释）0.2ml、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。

2）采血及培养。常规消毒采血部位，以含肝素（500U/ml）湿润注射器取静脉血3ml，混匀血标本，无菌条件下用7号针头垂直将血28～30滴（成年男性28滴，成年女性30滴）置外周血培养液内。将培养瓶放入37℃恒温箱中静止培养68～72h，第2天注意观察培养液有无凝血、溶血或长菌现象，可每日将培养瓶摇一摇，以便细胞获得充分营养。

3）积累分裂中期细胞。培养完成前2～3h加入浓度5μg/ml秋水仙碱溶液200～300ml，放回温箱继续培养。加秋水仙碱时间依研究目的不同而异，在细胞遗传学诊断中通常培养66～70h之间加入秋水仙碱，最终浓度以0.075μg/ml为宜。

4）染色体标本制备。收集细胞：用吸管将培养物吸至10ml离心管中，2000r/min离心10min。低渗：弃上清，向管沉淀物加入6～8ml已预温至37℃的0.075mol/L氯化钾溶液，用吸管充分混匀，放入37℃水浴箱温浴30min。预固定：取出离心管，加入新配的固定液（甲醇与冰醋酸之比3∶1）约1ml，轻轻混匀后2000r/min离心10min。固定：弃上清，加固定液6～8ml，轻轻混匀，2000r/min离心10min，再重复1次。滴片：弃上清，用固定液将沉淀调成细胞悬液，浓度合适（似毛玻璃样即可），取2或3滴滴至玻片上，在火焰上稍过一下。烤片：为使染色体老化，可放入75℃烤箱烤3h或37℃烤箱3～4d。

（2）精子染色体标本制备。方法有精液染色体标本制备与直接制备。

1）精液染色体标本制备。人精液中处于分裂的细胞最高可达5%，可对精液处理后进行细胞遗传学分析。步骤如下：清洁干燥的玻瓶收集新鲜精液，37℃水浴30min，加入浓度1 μg/ml秋水仙碱，37℃水浴30min。加入等量已预温37℃的0.075mol/L氯化钾溶液，用吸管充分混匀，37℃水浴30min。取出标本，室温自然沉淀30min，用吸管吸取中层液体，转入清洁离心管中离心。去上清液，加入低渗液5ml，混匀后37℃水浴30min，去上清液，加入新配甲醇/冰醋酸固定液（3∶1），轻轻混匀，置4℃冰箱30min，再离心弃上清，重复固定3次或4次，每次15min。弃上清，用固定液将沉淀调成细胞悬液，浓度合适，取2～3滴滴至冰片上，火焰上稍稍过一下，60℃烤箱烤18～24h。

2）直接制备。根据人精子与没有透明带的金黄地鼠卵受精后，受精卵中的雄性原核就进入分裂期，从而得到中间分裂相进行染色体分析。具体方法如下：

精子的准备：用BWW液常规处理精液，精子在含3%人血清白蛋白的BWW液（高蛋白BWW液）中孵育3h后加入Caionophore A 23187，最终浓度0.015μg/ml,37℃放置10～15min, 1200r/min离心5min，去上清，加入高蛋白BWW液，调节精子浓度为1×105/ml，放入37℃培养箱5～10min，取上层液体10μl加入40μl高蛋白BWW液，在培养皿中制成50μl受精小滴，盖以石蜡油。

金黄地鼠卵的准备：2～7个月的金黄地鼠可用于超促排卵，在发情期第1天早晨腹腔注入孕马血清促性腺激素25～30U，第3天晚11时注射HCG25U,15～17h后输卵管内就积累了含有卵的细胞团块，处死鼠取出输卵管，放入BWW液中，分别用0.1%玻璃酸酶和0.1%胰蛋白酶消化，使卵的透明带溶解，再将卵加入受精小滴中。

地鼠血清的制备：将被取卵金黄地鼠腹股沟处用乙醇消毒，剪开皮肤暴露股动静脉，剪断血管，用已被生理盐水湿润管壁的干净离心管接血，每只鼠可取5～6ml全血，置4℃24h后取析出的血清，1500r/min离心3min，吸出血清，正压过滤灭菌，56℃灭活30min，再分装于无菌小瓶中，-70℃保存。

受精卵培养液的配置：Ham F10粉剂0.245g、Hopes 0.119g、谷氨酰胺0.008g、2.87%NaHCO30.25ml、地鼠血清9ml、抗生素适量，配置后总量为34ml。

受精卵的观察与培养：受精后2～3h检查是否受精，将受精的卵转入新的小滴中培养，培养第2天检查活细胞数，标准为胞膜光亮完整，折光性好。当80%～90%原核消失后开始制片。

制片：将受精卵转入含秋水仙碱的培养液液滴中温育4～7h，然后将其固定在玻片上，用0.9%枸橼酸钠与0.075mol/L氯化钾（1∶1）低渗液低渗9min，再用冷的甲醇/冰醋酸固定液（3∶1）固定30s，吸出受精卵并轻滴在清洁玻片上，待固定液快干时加滴2或3滴室温固定液。标本经1周老化后进行显带处理。

2．染色体核型分析方法 包括染色体非显带核型分析与显带核型分析，多采用染色体显带核型分析。

（1）染色体非显带核型分析。显微镜下选择染色体完整、铺展良好的细胞进行检查。将染色体计数，观察有无结构畸变。常规检查50～100个细胞，挑选2～3个细胞显微摄影，把每条染色体剪下，配对编组，进行染色体核型分析。

（2）染色体显带核型分析（以G显带、C显带核型分析说明）。①Giemsa液制备：Giemsa原液：Giemsa色素1g、甘油66ml、纯甲醇66ml，研钵中将Giemsa色素用甘油研磨溶解，再放置55～60℃温箱内2h，不时摇动使其溶化，取出冷却后加入甲醇，室温放置1～2周后过滤备用。Giemsa工作液：取原液1份加入pH7.4磷酸缓冲液10～40份，混匀即可，每次用时新鲜配置。②G显带核型分析：将上述制备好的玻片放在预温至37℃的0.025%胰酶溶液中（pH7.2～7.4）轻轻摆动消化，时间酌定，一般90s左右。可先试一张片子，根据显带效果调整胰酶作用时间，再放在预温至37℃的0.85%NaCl溶液中漂洗2次，在预温至37℃的Giemsa溶液中染色10min左右，自来水冲洗干净，干后阅片。③C显带核型分析：将制备好的染色体片放入饱和氢氧化钡溶液中，58℃水浴5min，用0.1mol/L盐酸漂洗，蒸馏水冲入，依次入70%、80%、95%、100%乙醇中各5min，空气干燥，放入2×SSC溶液（氯化钠17.53g、柠檬酸钠8.82g，加蒸馏水至1000ml）水浴1～2h, Giemsa染色，阅片。

3．结果判断 染色体异常包括染色体数目异常与染色体结构异常。

（1）染色体数目异常。有整倍体和非整倍体两类。一个正常配子（精子或卵子）的全部染色体为一个染色体组（n=23），整倍体指染色体数目整组地增加，如三倍体（3n=69）、四倍体（4n=92），非整倍体体细胞中染色体不是整倍体，而是比二倍体多或少一条或几条。染色体和性染色体都可出现非整倍体。某一对染色体缺少一条称为单体型（2n-1），如45, XO称为X单体，45, XX, -16为16单体。某一对染色体增加一条至多条，称为多体，如47, XXX为X三体，47, XY, +21为21三体。染色体总数不变，2n=46，但某一对染色体缺少一条，另一对染色体增加一条，或缺少了一条或多条染色体，同时又增加一条或多条标记染色体，这种情况称为假二倍体。染色体数目稍多于二倍体称为超二倍体，染色体数目稍少于二倍体称为亚二倍体，余此类推。从一个合子发育而成的个体可以有两个或更多的细胞系，如果各细胞系的染色体构成不同则该个体称为嵌合体。

（2）染色体结构异常。主要有以下类型。①衍生染色体：染色体断裂后以不同方式互相连接，形成不同结构的染色体。②缺失：染色体末端或中间部分丢失。③倒位：一条染色体内发生两处断裂，形成上中下3个节段，中段旋转180°，上下颠倒后和上下两段重新连接，有臂内倒位和臂间倒位。④易位：两条非同源染色体发生断裂后，断裂部分互相交换并重新连接起来造成染色体之间重新排列。根据易位后遗传物质的组成情况可分为平衡易位和不平衡易位，根据易位的位点可分为相互易位（rcp）、罗伯逊易位（rob，两个近端着丝粒染色体发生断裂，常在着丝粒处重接），还有3条以上的染色体之间相互交换断裂节段的复杂易位。⑤插入：某条染色体在两处发生断裂，其中段转移到同一染色体的另一断裂处或另一染色体的断裂处，形成一条衍生染色体，插入可看成是易位的一种形式。⑥重复：染色体组内任何额外染色体或额外节段的增加，如多倍体、多体型、部分多体型等。⑦环状染色体：一条染色体的长臂和短臂在两端附近各发生一次断裂，有着丝粒节段的两端借断面彼此连接形成的染色体。⑧等臂染色体：细胞分裂中期的着丝粒发生横裂可形成两条臂长度相等而且又同源的染色体。⑨双着丝粒染色体：具有两个着丝粒的染色体。⑩标记染色体：细胞系内全部或大多数细胞内均出现同一形态的额外染色体，此额外染色体由数目畸变或结构畸变而来。⑪姐妹染色体单体互换：遗传上相同的姐妹染色体单体于细胞分裂期发生断裂，并相互交换染色体片断。○12四射体：两条非同源染色体之间发生联会。

二、分子遗传学检查

荧光原位杂交（FISH）技术采用免疫荧光和分子杂交技术，将细胞遗传学和分子遗传学结合起来，通过特殊荧光素标记DNA探针，在染色体制片、细胞滴片或组织切片上进行DNA或RNA杂交，经免疫荧光显色，对细胞内特定的DNA或RNA序列进行定性、定位及定量。FISH是染色体显带技术的补充和发展，用FISH技术检测染色体数目异常和微小结构异常，结果快速、准确，比传统细胞遗传学诊断具有明显优势，成为遗传学强有力诊断技术。FISH广泛应用于染色体异常、肿瘤诊断、治疗监测、基因定位研究等。在FISH技术基础上衍生micro-FISH（包括染色体显微切割、PCR和反向染色体涂染技术）、纤维荧光原位杂交（Fibre-FISH）、比较基因组杂交、引物原位标记、光谱核分析等，能将染色体复杂和微小畸变或基因突变清楚显示出来。

1．基本原理 碱基互补配对，同源DNA-DNA双链或DNA-RNA链在一定条件下可以合成双链。用放射性或非放射性物质标记DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，可探测细胞基因组中的同源部分。FISH技术将结合了荧光分子的探针杂交于对应的靶染色体或染色质的位置，从而检测特异DNA序列。如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在荧光显微镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

2．基本过程 基本过程包括探针制备及标记、标本制备、探针与标本变性与杂交、杂交后洗涤与复染、荧光信号检测等步骤。

（1）探针制备及标记。探针制备与标记比较复杂，有直接标记与间接标记探针，一般实验室检测探针都能直接购买。直接标记探针是将荧光物质直接标记到探针的dNTP上。间接标记探针的半抗原分子多采用生物素或地高辛等，分别与有特异性高度亲和力的抗生物素或抗地高辛抗体为检测配体，在配体上分别连接不同的荧光物质，如异硫氰酸荧光素（FIFC）或得克萨斯红（Texas red）以及其他染料，背景多用碘化丙啶（PI）或4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）等荧光染料复染，再在荧光显微镜下观察杂交信号。

探针分3类，根据检测目的选用探针：①单拷贝探针，常用于疾病相关基因定位、染色体微小缺失和异常染色体断裂点分析。②简单重复序列探针，是异染色质着丝粒探针，其靶序列位于染色体着丝粒区或Y染色体长臂等区，这类探针杂交所用时间短、信号强，主要用于识别标记染色体来源和检测染色体数目，在精子非整倍体检测中常用。③染色体涂染探针，杂交后能将整条染色体特异性涂上颜色，在分析染色体结构异常如易位或复杂的结构紊乱时快速、准确。

（2）标本制备。FISH适用标本有中期和间期染色体2类。中期染色体按标准细胞学方法制备。间期核细胞是直接滴片的未培养细胞，如精子细胞、卵细胞等，但这些细胞需经各种不同的预处理，以便探针掺入间期核并降低荧光背景。制备好的玻片可立即使用，也可冷冻数年后使用。

（3）探针与标本变性及杂交。在变性液和杂交液中分别加入70%和50%左右的变性剂甲酰胺，使变性和杂交可分别在70℃和37℃左右完成，保持染色体或间期核形态稳定性。一般杂交16h，重复序列探针杂交4h。

（4）杂交后洗涤与复染。杂交结束后，洗脱除去非特异性吸附分子。直接标记的探针杂交后直接加入PI或DAPI复染，而用生物素标记的探针需通过抗生物素蛋白结合荧光素而显色。

（5）荧光信号检测。荧光显微镜下观察杂交信号。

3．FISH技术步骤 FISH具体操作过程参考探针试剂盒所提供的步骤。下面介绍直接着丝粒探针用于外周淋巴细胞染色体中期分裂相杂交过程、间接标记着丝粒探针杂交过程以及精子非整倍体FISH过程。

（1）直接标记的着丝粒探针步骤（Vysis公司）。①标本制备：按标准细胞遗传学方法制备中期染色体，70%、80%、100%乙醇脱水各2min，空气中干燥。②杂交：从-20℃冰箱取出探针和杂交液，室温下解冻。吸取探针1μl、纯水2μl、杂交液7μl，如用3种探针则各取探针1μl，杂交液7μl，总体积均为10μl。离心1～3s，混合后再离心1次。将探针混合物加到玻片上，盖上盖玻片，封好边。培养的淋巴细胞共变性温度为75℃1min，杂交温度为42℃，时间30min到过夜。③洗涤：取下盖玻片，玻片放至0.4×SSC/0.3%NP-40中，73℃±1℃，搅动1～3s，洗2min后取出。将玻片放至2×SSC/0.1%NP-40中搅动1～3s，洗5s～1min后取出。④复染：加10μl DAPI，盖上盖玻片，暗室中10min。⑤荧光镜下观察结果。

（2）间接标记着丝粒探针步骤。按标准细胞遗传学方法制备中期染色体。将pH7.0～7.5的变性液（70%甲酰胺/2×SSC）放入水浴中预热到75℃。将玻片插入预热的变性液中3～4min，迅速将玻片插入预冷到-20℃乙醇中，依次70%、90%、100%各2min。从-20℃冰箱中取出探针，室温下解冻，轻轻振动后离心，74℃水浴变性5min，迅速插入冰水中，约5min。加10μl探针到标本上，盖上盖玻片，封好rubber cement，放入湿盒中37℃杂交过夜。将50%甲酰胺/2×SSC放入水浴中预热到43℃，去除盖玻片，将玻片插入洗涤10min，再重复1次。将玻片在37℃2×SSC中洗2次，每次4min。将玻片在室温下SSCT（20×SSC100ml、吐温-20500μl，加水至500 ml）中洗脱2min。取出玻片，加入30μl抗生物素标记的异硫氰酸荧光素（avidin-FITC），盖上盖玻片，37℃温育30min，去除盖玻片，将玻片室温下SSCT洗脱3次，每次2min，再重复加入avidin-FITC、温育、洗脱2遍。加10μl DAPI，盖上盖玻片，暗室中10min。荧光镜下观察结果。

（3）精子非整倍体检测步骤。根据目的可选双色、三色及多色FISH。精子FISH原理与步骤与外周血FISH基本相同，只是由于精子核染色体紧密凝集，探针难以穿透，一般先用二硫苏糖醇（DTT）处理，使精子头部胀大，染色质去凝集，使探针易于进入。下面介绍双色FISH方法。①标本处理：液化精液加入含6mmol/L 01乙二胺四乙酸（01EDTA）的磷酸缓冲液（PBS）中，精子密度（10～20）×106/ml,2000r/min离心5min，弃上清。用2mmol/L DTT/PBS至上述浓度重悬精液，室温45min，不断混匀（每隔数min），离心去上清。用PBS重悬，混匀后离心，用PBS洗2次，加8ml固定剂，室温30min,2000r/min离心5min，用新鲜固定剂重悬，共固定2次，加10～14滴固定剂，滴片。玻片可直接用于FISH或-20℃保存。②玻片标本准备：0. 1μg/μl RNA酶150～200μl，室温下37℃1h,2×SSC中洗2min，依次70%、85%、100%乙醇脱水各2min。③探针选用：采用Cytocell公司探针，绿色荧光（FITC）标记的探针为α-卫星X染色体着丝粒特异DNA探针和红色荧光（Texas red）标记的探针为α-卫星Y染色体着丝粒特异DNA探针。④变性：将探针从-20℃取出，平衡至室温，充分混匀探针，每次试验取10μl探针于离心管中。将探针水浴75℃7min，迅速放入冰格至少3min（避光）。玻片放入变性液（75%甲酰胺/2×SSC）中72℃2min，迅速放入冰乙醇70%、85%、100%各2min。⑤杂交：将10μl探针加到标本上，盖上盖玻片，用rubber solution glue封好，完全晾干。在湿润避光的容器中（37±1）℃孵育过夜。⑥洗涤：去除盖玻片，玻片放至0.4×SSC（72±1）℃, pH7.0洗2min，不要搅动。玻片放到2×SSC/0.05%吐温-20中，室温pH7.0洗30s，不要搅动。加10μl DAPI，盖上盖玻片，暗室中10min后观察结果。

4．基因突变的分子遗传学检测 运用分子生物学方法检测多种已发现的与男性不育相关的基因，如染色体微缺失。常用检测方法有PCR、STSS-PCR、Fibre-FISH、多重PCR、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）及探针技术（Southern blot或Northern blot）、毛细管电泳技术、基因芯片技术等，其中PCR应用最广。STSS-PCR在检测Y染色体微缺失方面最快捷、全面，它是利用一系列经PCR扩增的序列标记位点技术，有针对地设计出一系列STSS序列，以检测基因缺失。在此介绍男性外周血Y染色体微缺失检测并具体说明该技术。

（1）外周血DNA提取。无菌采血2～3ml,100μl EDTA抗凝，混匀，3000r/min离心10min，去上清，加入5～10倍体积红细胞裂解液（氯化胺3.851g、0.5mol/L pH8.0 EDTA1ml、1mol/L pH7.5 Tris 5ml，加水至500ml,4℃保存），充分混匀，冰浴至透明，3000r/min离心10min，去上清。加适量STE液（0.5mol/L pH8.0 EDTA 25ml、1mol/L pH7.5 Tris 5ml、NaCl 1. 45g，加水至250ml,1mol/L NaCl调pH8.0），一般2～3ml，混匀，使细胞悬浮，加蛋白酶K使终浓度100μg/ml，混匀，加入10%SDS，终浓度0.5%，混匀，56℃2h或37℃过夜。加入等体积苯酚，混匀，3500r/min离心10min，取上清，加入等体积苯酚，混匀，3500r/min离心10min。加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1）混匀，3500r/min离心10min，取上清，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积乙酸钠，轻轻摇动，见白色沉淀析出。吸管吸出沉淀，70%乙醇洗1次。干后加入100～150μl TE液（0.5mol/L pH8.0 EDTA 0.5ml、1mol/L pH7.5 Tris 2.5ml，加水至250ml，高压灭菌，4℃保存）溶解，-20℃保存。

（2）Y染色体微缺失检测。①DNA样品定量：原液5μl稀释到95μl TE缓冲液中；1μl稀释样品，加水4μl，用标准浓度DNA做对照；8%凝胶电泳，75V,20～30min；观察、判定浓度，使标本最终浓度稀释到25ng/ml。②Y缺失引物作PCR扩增：准备DNA混合物：DNA10μl（25ng/ml）、Taq酶1μl、水14μl，总体积25μl；男性标准对照DNA用5μl、水19μl，余同前。每个样品准备4个管，解冻A、B、C、D 4个引物，每管取20μl，将DNA混合物加入每管内，各5μl混匀，加1滴矿物油。运行程序：94℃4min、58℃30s、72℃1min,35个循环，72℃ 5min。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（共50ml,30%丙烯酰胺13.3ml、蒸馏水26.35ml、5×TBE 10ml、10%过硫酸铵0.35ml、四甲基乙二胺17.5μl）。样品准备：5μl PCR产物加1μl上样缓冲液混匀。标准分子量：5μl DNA ladder加入1μl上样缓冲液，加水2μl。电泳：120V,4～5h。染色：取下凝胶，固定液6min 2次，银染（0.2%硝酸银）10min 1次，蒸馏水2次或3次，显影7min左右。将标本显示条带与正常男性显示条带比较，记录缺失条带。

第五节 睾丸活检与病理检查

睾丸活检与病理检查在睾丸病变诊断与不孕治疗上具有重要意义。传统睾丸活检切片检查时，若证实为睾丸生精功能异常则意味着不可能通过正常孕育方式获得后代。但这些患者约27%经细针采样检查仍有精子存在。阻塞性无精子症患者睾丸几乎100%发现精子，可能通过ICSI技术孕育。在人工辅助生育技术日益成熟的今天，睾丸活检适应证延伸到所有无精子症患者，甚至FSH明显升高、睾丸偏小者，即使其睾丸发育不良，仍是睾丸活检指征。睾丸活检进行生殖病理观察，能直接评估精子发生的功能状态与障碍程度，评价生殖能力；无精子症可鉴别是输精管道阻塞还是生精功能损伤；了解睾丸合成类固醇的能力及其障碍情况；生精功能障碍者睾丸活检有时可发现极少量的精子或单精子，从而行ICSI治疗，获得受孕机会。

一、睾丸活检

（一）睾丸活检适应症

活检为有创检查，可能导致并发证，应掌握适应证，目前比较公认的适应证有如下几种。①无精子症：生殖内分泌激素水平与睾丸体积检查正常。②少精子症：精子密度（2～10）×106/ml，而FSH值在正常范围。③精索静脉曲张致少精子症：了解精索静脉曲张影响睾丸生精能力程度。④隐睾：既往有隐睾史，青春期后方行睾丸下降固定术，活检可了解睾丸生精能力，同时排除睾丸恶变。⑤精道梗阻：通过活检了解睾丸生精能力，以决定行精道吻合手术或ICSI。⑥睾丸肿物：睾丸肿物不明，进行性增大，或疑恶性变者。

（二）活检睾丸选择

已明确的单侧睾丸病变，如一侧睾丸肿物，活检选择病变侧睾丸。了解睾丸生精能力应双侧活检。无精子症作生精功能障碍或阻塞鉴别时应双侧睾丸活检。精索静脉曲张不育症由于波及对侧睾丸，主张双侧睾丸活检。输精管道重建手术前应做双侧睾丸活检以明确生精功能是否正常，以及生精上皮损伤是否不育的原因。隐睾时成年患者睾丸固定术后应做双侧睾丸活检，以排除原位癌。一侧睾丸因肿瘤切除应做另一侧睾丸活检，有5%对侧睾丸肿瘤或原位癌发病率。

（三）睾丸活检方法

睾丸活检方法分为睾丸切开活检及经皮穿刺活检。

1．睾丸切开活检 ①麻醉：1%利多卡因或1%普鲁卡因于拟切开处阴囊皮肤行局部麻醉和精索阻滞麻醉。②手术步骤：用左手拇指及示指将睾丸固定于切开处阴囊皮下，选择睾丸体部（避开附睾）阴囊前壁皮肤处作一0.5～1cm长切口，逐层切开阴囊壁各层后至睾丸白膜，用小拉钩将切口充分暴露，适当挤压睾丸组织，于白膜上再作一小切口，可见睾丸组织从切口处膨出，用剪刀切出3mm×3mm×2mm组织即可，不可小于1.5mm3，所取组织送病理检查。白膜处切口用3～0号丝线缝合，皮肤切口用1～0号丝线缝合。为了方便，在切开白膜前可于拟切开处周围先用3～0号丝线作一荷包缝合，切开白膜取出组织后直接打结关闭切口，可避免取出组织后因出血及白膜切口移位而致白膜切口处缝合不满意。③活组织处理。固定：取下的睾丸组织立即用Bouin液固定，不宜用甲醛液固定，甲醛可使睾丸组织皱缩，生精细胞脱落、核固缩，间质细胞肿胀，支持细胞变形，影响诊断；如进行电镜观察，可置戊二醛液内固定。染色：一般用苏木精-伊红染色，采用Masson三色染色可显示生精小管壁及周围结缔组织和间质细胞结构。较好的固定液有Bouin液（饱和苦味酸水溶液75ml、40%甲醛水溶液25ml、冰醋酸5ml，此液固定10h左右为佳，特别是需行免疫组化检测的标本用此液）及Carnoy液（三氯甲烷30ml、冰醋酸10ml、无水乙醇6ml，此液固定1.5～2h为佳）。如要进行免疫组织化学检查，取下的标本应放入相应的固定剂内或作冰冻切片，或放入液氮中暂时冰冻保存。要作睾丸超微病理学检查应采用相应的固定剂和制片技术。

2．经皮穿刺活检 ①麻醉：1%利多卡因或1%普鲁卡因于穿刺阴囊皮肤处行局部麻醉。②穿刺方法：用左手拇指及示指将睾丸固定于穿刺处阴囊皮下，以16～18号或23号穿刺针经皮穿入睾丸内吸取组织条块。也可用带钩的组织穿刺枪取出条丝状的睾丸组织。所取组织送病理切片检查。诊断性活检只需50～150mg外周曲细精管。

（四）并发症

仔细、严格操作，睾丸活检并发证甚少，可见下述并发症。

1．误穿附睾 最严重的并发证为误穿附睾，日后可能发生附睾梗阻。

2．阴囊疼痛和血肿 血肿常发生于切开活检手术，在切开白膜前于拟切开处作一标志，可防止缝合时找不到切开部位，有助于活检后缝合止血。若在缝合前白膜切开处找不到，应将皮肤切口延长，并将睾丸提至切口外，继续寻找睾丸切开处并缝合。鞘膜血液供应丰富，其切开边缘出血处应缝合止血。

3．感染 消毒不严可引起感染。因血运丰富，穿刺后若无血肿感染率低，无需常规使用抗生素。

4．免疫反应 睾丸活检后是否引起免疫反应有不同看法，有认为可引起免疫反应，产生免疫性睾丸炎，有人检测活检后5周精子凝集试验与制动试验阳性反应。又有人认为睾丸活检损伤小，一般不会引起免疫反应。但活检必定是有一定的创伤性检查，应慎重选用，一般是无精子症和严重少精子症，或高度疑有癌症时考虑选用。有些病例在睾丸活检后数周内精子数量可下降，一般3～4个月后即可恢复。

（五）注意事项

匆挤压所取活检组织，以免造成组织结构破坏。为了不损伤睾丸组织结构，不宜用钳夹睾丸组织。有睾丸手术史，正常解剖结构被破坏，可能使附睾分界不清或白膜难以分离，应延长皮肤切口，将睾丸提至切口外活检。经皮穿刺活检为一非精确性穿刺，可能导致睾丸或附睾血管损伤，穿刺后可使白膜外间隙消失，给随后的输精管-附睾吻合术、附睾穿刺等带来一定困难。既往有阴囊手术史者因解剖结构紊乱不宜经皮穿刺。

二、睾丸活检病理检查

（一）病理检查内容

睾丸活检病理检查时应注意以下几个方面内容。

1．生精小管数量和大小 生精小管（或称精曲小管）为睾丸主要组成部分，一般正常长50～80cm，管径150～300μm，注意生精小管有无萎缩和塌陷，或过度扩张等情况。

2．生精小管与间质的比例 睾丸由大量生精小管组成，此小管被含有间质细胞、血管、淋巴管和结缔组织的松散组织所分隔。睾丸间质面积约占睾丸面积36%。观察时注意生精小管与间质的比例有无变化，间质组织有无增生，如有应区别是弥漫性还是局灶性增生。

3．生精细胞 生精小管内表面由复层上皮构成，统称生精上皮，有单层的支持细胞与生精细胞。生精细胞分为不同发育阶段，包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及精子。生精上皮的基膜将生精细胞及支持细胞与间质中的血管与淋巴管分隔开，在基膜上排列的生精细胞中，愈成熟愈靠近支持细胞顶端而远离基膜。正常生精过程表现出严格的空间和时间顺序，可分为6期，依成熟程度排列成5～6层同心圆，从基膜起向管腔内方向分别为精原细胞、支持细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及精子。每期都有一定的细胞组合，并占一定的比率，依次分别为29.8%、19.6%、6.4%、7.7%、31.3%、3.2%。若每期的细胞组合或每期所占比率发生改变，表明精子发生障碍。注意观察正常细胞组合中有无某些细胞缺失或某一阶段细胞堆积。若有某一类细胞缺失或堆积，表示某一环节发生了障碍或生精阻滞。还要注意各级生精细胞形态结构的异常，未成熟的生精细胞脱落、生精细胞的坏死等现象。对于支持细胞除观察一般形态结构外，还要注意支持细胞的类型，即成熟型支持细胞、未成熟型支持细胞及部分成熟型支持细胞。青春期前均为未成熟型支持细胞，青春期后正常情况下应转变为成熟型支持细胞。

4．生精小管界膜 生精上皮的基膜上有一层很薄的基膜，其外面由一层固有膜包绕，此固有膜称为生精小管界膜，分为3层，紧贴基膜的为无细胞层，其外层为类细胞层，其中有数层肌样细胞，这些肌样细胞的节律性收缩可使生精小管中的精子和液体缓慢流动与排泄，炎症时胶原纤维增生可使功能减退，最外层由淋巴细胞与成纤维细胞构成。要重视观察生精小管界膜的厚度，有无纤维化和透明变性。

5．间质和间质细胞 正常间质细胞嗜酸性圆形或多边形，细胞质中含有Reinke晶体，成簇散在分布于间质中。注意观察间质细胞的数量和形态结构。间质细胞如有增生，要区分是局限性或弥漫性增生。注意间质中淋巴细胞炎性浸润、间质水肿、间质小血管管壁增厚、管壁纤维化、管壁透明变性等病理变化。

6．其他 其他睾丸疾病的组织病理学改变。

（二）病理分类

1．正常或基本正常的睾丸结构 睾丸活检组织呈现正常或基本正常的组织结构，生精小管可见各级生精细胞和支持细胞，管腔面有许多精子，生精小管界膜及间质也无明显异常。此种情况应结合临床及精液检查考虑，如精液检查为无精子症，睾丸大小、质地正常，附睾尾部饱满，很可能为阻塞性无精子症，应进一步明确阻塞部位。

2．生精功能低下 生精小管中所有的生精成分均减少。组织病理特征是包括精原细胞在内的各级生精细胞都存在，有精子发生，精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子的数量相对比例可正常，但其绝对数量均比正常减少，从而导致最终产生的精子数减少，精液中则表现为少精子症或严重少精子症。如生精功能极度低下也可表现为精液无精子症。生精细胞层变薄，细胞排列紊乱和脱落，生精小管管径变小，界膜增厚，间质纤维增生及小血管透明样变性。其生精功能损伤是不可逆的。原因复杂，常见有精索静脉曲张、各种毒物、免疫因素、流行性腮腺炎及内分泌因素等。

3．生精阻滞 或称精子成熟障碍，是生殖细胞分化过程中断，属细胞分化障碍。生精阻滞可发生在不同时期的生精细胞，即发育停滞在初级精母细胞、次级精母细胞、或精子细胞，其中以终止于精母细胞最常见，所有生精小管中精子发育阶段一致，但不同患者生精停滞阶段可不同。某些后期成熟障碍时病理学检查较难与正常生精区别，精液中可有不成熟的精母细胞，但无精子形成，也可为部分成熟障碍，有成熟精子但数量减少，表现为少精子症。原因有原发性与继发性。原发性主要是遗传原因，主要包括一些体细胞染色体异常和生殖细胞染色体异常。继发原因中主要是化疗与放疗，抗生素如呋喃坦啶、庆大霉素、硝米达唑（精母细胞型生精阻滞），维生素A缺乏（精母细胞前期型生精阻滞），锌缺乏，阴囊温度增高（长期桑拿和发烧，初级精母细胞型生精阻滞），感染因素（细菌性附睾-睾丸炎），内分泌因素（促性腺激素缺乏生精可停滞在不同阶段，LH或HCG对精原细胞型生精阻滞可能有效，至精子出现需18±9.8个月），肾上腺皮质甾体激素产生过多导致肾上腺性腺综合征（精母细胞型生精阻滞，HCG治疗可恢复精子发生）。

4．惟支持细胞综合征 其特征是睾丸生精小管生精细胞完全缺失，生精上皮仅由支持细胞组成。有先天性与继发性。先天性生精上皮发育不全是由胚胎期卵黄囊内胚层原始生殖细胞未形成、不分裂、死亡或未降到生殖嵴所致。此类病理特点为几乎所有的生精小管中见不到生精上皮而只能见到支持细胞，生精小管管径、界膜及睾丸间质可无任何改变，睾丸和第二性征可正常。继发性生精上皮发育不全由于后天原因引起生殖细胞完全脱落而仅余下支持细胞，这是一个发展过程，与生精小管界膜或间质小血管有关。生精小管界膜为生精细胞营养及代谢物质交换唯一通道，参与精子的输送、免疫反应及影响生精细胞，界膜增厚影响生殖细胞营养与代谢，导致发育障碍。间质小血管透明样改变可导致睾丸微循环障碍而影响睾丸发育，因此，继发性生精上皮发育不全时，除生精上皮发育不全外还有其他病理改变。

5．生精小管透明样变性 生精小管基膜及管周纤维组织广泛透明样变性，甚至生精小管萎缩，生精小管内生精过程严重抑制，严重者生精细胞和支持细胞消失。透明变性主要表现是生精小管基膜增厚，呈均质状透明样变，可向生精小管管腔及间质两个方向扩延，致使管腔日益变小，基膜皱缩不规则，间质小血管管壁也可增厚，基膜发生透明变性，管腔变小。生精小管和间质血管透明变性，可严重影响生精小管和间质之间正常物质交换，影响生精小管微环境及精子发生，致使生精小管生精细胞脱落和变性，直至消失，仅剩下支持细胞，进一步发展支持细胞也明显受损害，发生脱落和变性解体。到一定阶段，整个生精小管可发生皱缩、塌陷，甚至仅有生精小管皱缩的影子。原因复杂，可能与非特异性炎症、腮腺炎、睾丸未降、睾丸外伤扭曲、某些药物、自身免疫等有关，也可能是其他生殖病理损害发展形成的一种非特异性损害。

6．混合性病变 病理表现存在两种以上的病变，即生精上皮发育不全和生精障碍混合存在，或合并界膜增生或透明样变性同时存在，或生精上皮脱落、排列紊乱、纤维化及透明变性等并存，但其中任何一种病变均不占优势。混合性病变可能是一种中间过渡型，在以后发展过程中，其中某种病损可能会发展得很严重，从而演变为其他类型损害。

7．未成熟型睾丸 正常青春期前睾丸属未成熟型睾丸。病理未成熟型睾丸指年龄已达到青春期或成年期，而睾丸发育仍停留在幼年未成熟阶段。生精小管未发育或未充分发育，其管径较同龄小，可无管腔，无精子发生，支持细胞也属未成熟型或部分成熟型。未成熟型睾丸实质上是发育不良睾丸，一般为内分泌性（促性腺激素低下性睾丸发育不良或周围性睾丸发育不良两类）。在周围性睾丸发育不良中克氏综合征、隐睾，特别是腹腔隐睾和严重的幼年腮腺炎性睾丸炎可导致睾丸发育不良，形成未成熟睾丸。近年来研究提示睾丸生长发育不仅与激素密切相关，还与睾丸局部产生的众多的肽类物质（睾丸生长因子）有重要关系，这些生长因子表达缺失或过度可导致睾丸发育不良。

8．间质病变 间质病变种类甚多，如间质增生、淋巴细胞浸润、间质水肿、间质小血管变性，同时应注意间质细胞变性。

9．精索静脉曲张 生精小管生精细胞各期可见，但排列紊乱，部分脱入管腔，界膜有纤维增生或透明样变，间质中间质细胞增多，血管内皮增厚。精索静脉曲张对睾丸的影响随年龄增长而进行性加重，年龄大的重度患者其生精小管中生精细胞在成熟前呈大片脱落，精原细胞较少甚至消失，支持细胞透明样变。其原因为静脉回流障碍，睾丸温度上升，阻碍精子发生；静脉压升高使睾丸静脉内二氧化碳积聚、缺氧而抑制精子的发生与演变。

10．其他 如促性腺激素减退性性腺功能低下症，生精小管明显变小，无生精细胞和间质细胞，与7个月大小胎儿睾丸活检结果相似。引起睾丸病变的因素是多方面的、复杂的，同一组织类型病变可由不同致病因素引起，同一致病因素在不同条件下可产生不同的组织病变。

（三）生精障碍评定

1．Johnsen10级积分法 通过观察睾丸组织病理变化，对生精小管予以评分，积分越高精子生成越好，反之精子生成障碍越严重，评分标准见表3-11。

2．Peace评分法 Peace综合采用Johnsen、Meinhard和Honore 3种评分标准，并结合生精小管管径、基膜改变情况5项指标更客观地评定睾丸功能，5项指标可以互相参照，避免单项评分的局限性。Meinhard和Honore评分标准见表3-12、表3-13。

3．抗精子生成效应评定法 从抗精子效应角度提出，积分越高抗精子生成效应越强，反之精子生成障碍程度越弱，此法特别适用于抗精子生成的男性抗生育研究，见表3-14。

4．睾丸生殖病理双重诊断法 根据睾丸生殖病理及精子生成障碍程度确定Ⅴ级分类法，见表3-15。

5．TMI分类法 主要观察生精小管（T）、生精小管界膜（M）和睾丸间质（I），见表3-16。

第六节 附属性腺及附睾功能检查

男性附属性腺主要包括前列腺、精囊腺和尿道球腺。附属性腺及附睾功能对男性生育有十分重要的意义。精浆成分几乎都来自于附属性腺。一些精浆生化标志物可反映性腺功能，如柠檬酸、锌、镁、谷氨酰转肽酶和酸性磷酸酶反映前列腺功能；果糖和前列腺素可反映精囊腺功能；游离左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和α-葡糖苷酶反映附睾功能等。这些特异标志总排出量的高低可用以评价男性副性腺的功能状态，也可用于综合评价不育的发病原因和机制。

一、前列腺功能检查

前列腺是副性腺中最大的不成对的实质性器官，其大小和形状似前后扁平的栗子。前列腺有外分泌和内分泌功能。成人前列腺持续分泌一种酸性稀薄液体，主要成分有柠檬酸盐、酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶、精胺、锌、免疫球蛋白以及促甲状腺素释放激素、松弛素和泌乳素等。精液中柠檬酸与酸性磷酸酶一般认为是前列腺的功能指标，在广泛炎症破坏时，其浓度降低。锌在前列腺含量较高，可能参与前列腺分泌的负反馈调节或作为多种酶的辅因子，在精子的代谢和运动过程中扮演重要角色。精浆酸性磷酸酶、精浆γ-GT及精浆柠檬酸测定已在本章第一节“精液生化测定”中介绍。

（一）前列腺液一般检查

1．标本采集 前列腺液标本通过前列腺按摩采集。前列腺按摩方法：患者排尿后采取膝胸卧位，检查者右手示指涂润滑剂后置于肛门外，可嘱受检者张口吞气以放松肛门，待其适应后再慢慢插入，直至触及前列腺，用力适中均匀，从前列腺两侧向中线按压2～3次，然后由中线向肛门口按压2～3次，并挤向会阴部尿道，前列腺液从尿道口流出。取样时将流出尿道口的第1滴腺液弃去。液量少时可直接滴在玻片上，量多时可收集在洁净干燥的试管内，并及时送检。采集微生物培养的标本须无菌操作，将标本收集在灭菌的容器内。疑为前列腺结核、脓肿或肿瘤禁忌前列腺按摩。一次按摩失败，或检查结果阴性，而有明确临床指征者，可隔3～5d后重新复查。

2．一般性状检查 正常成年男性经前列腺按摩一次可采集数滴至1ml前列腺液。前列腺炎时多减少，甚至采不出。正常的前列腺液稀薄，呈淡乳白色。前列腺或精囊炎时可变黏稠、混浊，呈脓性，有时含絮状物或黏液丝。若有出血可呈不同程度的红色，见于精囊炎、前列腺炎、前列腺结核、结石和恶性肿瘤等，也可因按摩时用力过重所致。正常前列腺液呈弱酸性，pH 6.3～6.5，超过50岁时稍增高，混入精囊液较多时，pH也增高。

3．显微镜检查 取样后立即进行显微镜检查，以免干涸。

（1）卵磷脂小体。正常前列腺液中卵磷脂小体几乎布满视野，均匀分布，呈圆形或卵圆形，与脂滴相似，折光性强，发亮，大小不等，可略小于红细胞，也可小于红细胞的1/4。前列腺炎时卵磷脂小体减少，分布不均，有成簇分布现象，严重者卵磷脂小体可消失。

（2）红细胞。正常前列腺液中偶见红细胞，在前列腺炎、结核、结石和恶性肿瘤时可见红细胞增多，按摩时手法过重也可见红细胞增多。

（3）白细胞。正常前列腺液中高倍镜视野下不超过10个，分散存在。若每高倍镜视野白细胞＞10个，成簇分布，是前列腺炎的指征之一。

（4）颗粒细胞。正常前列腺液含有一些体积大的细胞即颗粒细胞，胞体较大，含卵磷脂小体颗粒较多，可能是吞噬了卵磷脂小体颗粒的巨噬细胞。正常前列腺液中此种细胞每高倍镜视野下不超过1个，前列腺炎时可增多达数倍至10倍，老年人前列腺液中也可见此种细胞增多。

（5）淀粉样小体。大小不一的分层状、同心圆线纹构造的嗜酸性小体，圆形或卵圆形，微黄或微褐色，形似淀粉颗粒，故名淀粉样小体，其中心常含碳酸钙沉积物，如与胆固醇结合可形成结石。前列腺液中的淀粉样小体随年龄增长递增，与疾病无明显关系。

（6）精子。因按摩时精囊受挤压而排出。

（7）滴虫。前列腺滴虫感染时可见到滴虫。

（二）前列腺液微量元素测定

前列腺液微量元素最主要的是锌，其次是镁、钙。前列腺含锌量较其他组织多，锌含量与前列腺液抗菌能力有关，锌还可能参与稳定精细胞膜的作用。前列腺炎时，锌含量降低，特别是细菌性前列腺炎锌含量明显降低。前列腺炎时镁、钙降低，尤其是慢性前列腺炎时更明显。

（三）氧化应激作用分析

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。ROS包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等。RNS包括一氧化氮、二氧化氮和过氧化亚硝酸盐等。用鲁米诺和辣根过氧化物酶处理标本，通过灵敏的照度计检测化学发光信号，可计算出过氧化氢产物的量。

分析方法：鲁米诺-过氧化物酶法。

临床意义：正常情况下，机体氧自由基的产生、利用、清除处于动态平衡，前列腺炎患者氧自由基产生过多或/和自由基清除体系作用相对降低，使其抗氧化应激作用的反应能力降低、氧化应激作用产物或/和副产物增加，可能为前列腺炎发病机制之一。

（四）内毒素测定

内毒素是存在于革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖，泌尿系统感染革兰阴性菌后，这些细菌在局部释放出内毒素，诱导和释放出过敏毒素、组织因子、血小板激活因子、肿瘤坏死因子等，产生病理生理效应。

测定方法：鲎试验，通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应来检测或半定量内毒素。

临床意义：革兰阴性菌感染引起的前列腺炎可见内毒素显著增高。

（五）免疫球蛋白测定

前列腺上皮组织内以及它的分泌物中含有IgA和IgG，健康人前列腺内IgA、IgG和IgM很少。当炎症明显时，除了腺体本身分泌外，血浆内的免疫球蛋白可进入前列腺。免疫球蛋白IgG、IgA、IgM与其相应抗体在液相中相遇，立即形成抗原抗体复合物，并产生一定的浊度。该浊度的高低与样品中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的含量成正比。

测定方法：免疫比浊法。

临床意义：出现大量IgM时，表明腺体血管的通透性增加。前列腺感染时，前列腺免疫球蛋白IgA、IgG增加，治疗后下降，这是前列腺细菌感染刺激前列腺抗体的局部免疫反应。慢性前列腺炎时，前列腺液中的IgA和IgG水平明显增高，与抗精子抗原形成有关。

（六）乳酸脱氢酶同工酶测定

前列腺液乳酸脱氢酶（LDH）有五种同工酶，即LD1、LD2、LD3、LD4和LD5。LDH每种同工酶所带电荷不同，可用电泳对LDH同工酶进行分离，再加入含有乳酸、NDA、氯化碘硝基四唑蓝（LNT）和吩嗪甲硫酸（PMS）的底物，即可用比色法测定标本中每种同工酶的相对含量。

测定方法：电泳法。

临床意义：在前列腺癌或其他各种恶性疾病时LD5含量增高。

（七）前列腺特异性抗原检测

前列腺特异性抗原（PSA）是由前列腺上皮合成的糖蛋白，具有丝氨酸蛋白酶活性，存在于前列腺液、精液和血液中。PSA是前列腺的特异蛋白，是前列腺癌最有价值的肿瘤标记物。

检测方法：ELISA、IRMA、CLIA和TR-FIA等。以IRMA为例，将抗PSA单克隆抗体包被到微珠上，再和标本中的PSA结合，然后加入125I标记的PSA抗体形成双抗体夹心免疫复合物，洗去多余抗体后在γ-计数器上测量放射活性，和同样处理的标准品相比，计算标本中PSA含量。

临床意义：增高可见于前列腺癌，前列腺炎和前列腺肥大等良性前列腺疾病也可见轻度升高。

二、精囊腺功能检查

精囊腺是高度盘曲的梨形腺体，分泌物约占射出精液的60%，其分泌物含有果糖、山梨醇、前列腺素、凝固因子和去能因子等，都与男性生育密切相关，其中果糖和山梨醇提供精子代谢所需要的能量。当精囊腺功能紊乱时，会导致精液总量减少，同时精液内果糖含量也会降低，引起精子活力不足，导致不育。精浆果糖测定对判断精囊腺功能十分重要，已在本章第一节“精液生化测定”中介绍。

三、附睾功能检查

附睾附着于睾丸的上端及后缘，为一长条状结构，由头、体、尾三部分组成。附睾在男性生殖生理中具有十分重要的作用，是男性生殖道的一部分，和精子的成熟具有密切关系。附睾上皮能分泌α-葡糖苷酶、唾液酸等功能标志蛋白，并可浓缩肉毒碱于头部远端和体部，与精子成熟和精子运动密切相关。精浆α-葡糖苷酶与精浆肉毒碱测定直接反映附睾功能，已在本章第一节“精液生化测定”中介绍。

第七节 超声影像检查

超声影像检查，尤其是经直肠超声影像检查在男性不育症许多疾病中都被成功应用。前列腺及精囊超声检查可以评价精液量减少或精液缺乏的原因，可以发现精囊缺失、发育不全以及射精管阻塞所引起的囊状扩张等。

一、前列腺及精囊超声检查

1．经腹部探测法 经耻骨上沿腹部探测，一般用3.5MHz或5.0MHz扇扫探头，适度充盈膀胱检查。横切面前列腺呈左右对称的栗形或三角形，包膜光滑整齐，内部为均匀散在的细小光点，一般不易分辨各区带。在前列腺两侧可见柳叶状低回声，有时像一副哑铃，是精囊。纵切面前列腺呈椭圆形，包膜光整，内部回声均匀，在前列腺后上方、直肠和膀胱之间，可见到略呈圆形的精囊。

2．经会阴探测法 由于会阴部组织较多，多用经腹部相同的探头，探头涂耦合剂，置于会阴部，向患者头端，进行冠状切面和矢状切面扫查。膀胱适度充盈，可以看清前列腺。

3．经直肠探测法 现多用端射式直肠探头。检查前排空大便或清洁灌肠，适度充盈膀胱，取侧卧位、截石位或膝胸卧位。探头套避孕套，外涂耦合剂，然后将探头慢慢送入直肠，探头先朝向剑突，一旦过肛门，改向胸椎方向，深度不超过10～15cm。

横切面前列腺呈半月形或新月形，左右对称，包膜光整，内部回声因区带有所不同，移行区、尿道周围腺和尿道内括约肌呈低回声，中央区和周边区在声像图上难以分辨，均呈等回声。纵切面图，前列腺近似椭圆形，包膜光整，内部回声因区带有所不同。中央区内可见射精管形成的管道，形似鸟嘴，称鸟嘴征，该征的消失提示射精管周围可能有癌肿侵犯。膀胱颈和尿道可作为正中矢状切面的标志，尿道内口微微凹入，后尿道呈纤细条带状回声，排尿可动态观察。大小一般为4cm（横径）×3cm（上下径）×2cm（前后径）。在前列腺底部两侧，呈两片柳叶状低回声，左右对称，囊壁清晰，壁厚约0.1cm，回声稍高。横切面上精囊与前列腺基底部之间可见高回声的纤维脂肪回声，纵切面这种脂肪回声形似乳突，突入前列腺和精囊之间，形成两者之间的正常角度。如果该纤维脂肪回声和正常角度消失，提示前列腺癌侵犯精囊。

前列腺炎声像图上有3个主要特征：①尿道周围出现低回声晕。②腺实质回声不均，出现多个低回声区。③前列腺周围因前列腺静脉丛充血、肿胀，出现无回声区。此外，前列腺轻度肿大，包膜有时模糊不清，但形态对称。慢性前列腺炎很少有特征性声像图改变，前列腺增大不明显，形态一般对称，包膜增厚或不整齐，内部回声不均，可有强回声斑及低回声，难与前列腺癌鉴别，常常合并前列腺结石。

精囊隐蔽，一般检查不易发现。经直肠超声显像能清楚显示精囊的形态和结构。精囊炎常伴发前列腺炎，声像图上表现为精囊扩大，变形，回声杂乱，不均匀。偶尔发展为精囊脓肿，呈囊性和实性交错的混杂回声。

二、阴囊超声检查

阴囊位置表浅，超声探测常规取仰卧位，托起阴囊。阴茎用胶布固定在腹壁上。隐睾、精索静脉曲张和斜疝的探测应取站立位，使隐睾和疝下降，精索静脉充盈，易于找到和显示病变。多用高频探头直接接触阴囊皮肤探测，如用一般探头（3.5MHz），则应在探头和阴囊之间隔以水囊。

1．正常声像图 睾丸呈卵圆形，内部回声细密、均匀，边界回声清晰、明亮，睾丸后上缘可见一条形光带，为睾丸纵隔。有时鞘膜腔内可见少量无回声液体。纵切面图上，睾丸上方可见到附睾头，呈半圆形或新月形，回声强度与睾丸近似，睾丸中部后方可见到附睾体，附睾尾很难显示。正常睾丸长径约3.83cm、宽径约2.46cm、前后径约1.92cm。

2．异常声像图 与不育症有关的常见阴囊疾病声像图特点如下。

（1）隐睾。隐睾很小，呈椭圆形，内部为低回声，边界清晰。超声常不易探测的隐睾，应注意在下述部位寻找，腹内隐睾在充盈膀胱周围和同侧肾脏下极附近容易找到，腹股沟管内隐睾及阴囊上方隐睾由于位置表浅，相对容易找到。

（2）急性睾丸炎。睾丸轮廓增大，内部回声细密，均匀，亮度中等，与精原细胞瘤相似，需结合病史和体征鉴别。

（3）睾丸血肿。睾丸内出现低回声区，形态不一，彩色多普勒显示低回声内没有血流信号。应结合病史与睾丸肿瘤鉴别。

（4）睾丸扭转。睾丸增大，呈中等回声，睾丸周围可见少量液性暗区。彩色多普勒显示睾丸内血流信号减少或消失。

（5）附睾炎。附睾增大，内部回声不均匀，可见斑片低回声区，表面皮肤增厚。正常情况下不易见到的附睾尾部也肿大，呈中等回声，形成脓肿者出现低回声。急性附睾炎可伴睾丸肿大，水肿明显可影响睾丸血供，引起局灶性或散在性低回声梗死灶。

（6）附睾结核。声像图与附睾炎相似，出现钙化强回声和声影时才能鉴别。

（7）鞘膜积液。很易辨认，表现为睾丸周围有一圈无回声区。液体包绕睾丸并延伸到精索，为婴儿型鞘膜积液。积聚的液体位于精索部位，不与睾丸相关，为精索鞘膜积液。交通性鞘膜积液由于交通的腔隙小，超声很难发现，不易与婴儿型鞘膜积液鉴别。

（8）精索静脉曲张。精索静脉走行迂曲，扩张，管径一般超过3mm，多数发生在一侧阴囊。亚临床精索静脉曲张诊断可依据超声检测3支以上的精索静脉，其中一支内径＞3mm，或腹压增高时静脉内径＞3mm，伴有自发性或Valsava动作时有反流。

第八节 放射影像检查

一、X线检查

（一）X线平片检查

平片可观察前列腺、精囊、阴茎有无结石、钙化，特别是畸胎瘤的骨骼、牙齿等。外生殖器官如阴茎和阴囊及其内容物可做软组织摄影，多在造影检查前作对照之用。

（二）造影检查

1．输精管及精囊造影 观察输精管、射精管及精囊生长发育状况，发现炎症、外伤、手术、囊肿与肿瘤等引起的变化，是确定输精管道梗阻及梗阻部位的有效手段。造影方法有经输精管法与经尿道逆行插管法2种。

经输精管法：有穿刺与切开2种方式，穿刺常用。常规皮肤消毒，普鲁卡因行皮肤及皮下浸润麻醉，切开阴囊外上部，用丝线提起精索，纵行切开精索至显露输精管，用注射针向腹侧刺入输精管，在显视屏监视下缓慢注入造影剂1.5～5ml，至输精管壶腹部、精囊及射精管均满意充盈为止。

经尿道逆行插管法：用后尿道镜在精阜两旁找到射精管开口，将输尿管导管插入1～3cm，在显视屏监视下注入造影剂2～5ml，摄点片或在各个位置摄取相应大片。一般先摄正位片，为避免精囊与射精管影与耻骨联合重叠，可使X线管中心线向足侧倾斜30℃，也可在仰卧状态下做X线水平投影，以显示精囊位置及膀胱和直肠的关系。

以上造影方法均需两侧分别注射造影剂，偶有注射一侧造影剂分流入对侧者。常用水溶性造影剂如50%泛影钠或泛影葡胺，现已很少使用油剂。

2．附睾造影 可确定附睾与输精管间有无阻塞。造影方法同输精管法，但针尖穿刺方向相反，进入输精管后向附睾方向注入造影剂0.5ml，注意压力不能太高，以免造影剂外溢，最好用结核菌素注射器。

3．阴囊造影 阴囊位置表浅，一般不需X线检查，但在特殊情况下，如睾丸慢性炎症和结核、睾丸萎缩、隐睾症、精索囊肿、鞘膜积液及精索静脉曲张等，造影可直接了解睾丸、附睾和精索的形态及同精索的关系。造影方法有3种。①空气造影：常规消毒，由阴囊中缝处向右穿刺，注入气体20～30ml，如有鞘膜积液，应先抽液后注气，注入的气体1周后可吸收。②碘水造影：常规消毒穿刺，注入10%造影剂10～20ml，可加入1%普鲁卡因少许。③空气碘水双重造影：先注入碘溶液10ml，再注入空气20～40ml，注射时有阻力应停止，以防发生气栓或损伤黏膜。造影剂注射后立即摄片，分别摄正位、侧位及斜位片。

4．阴茎海绵体造影 适用于检查阴茎外伤、阴茎硬结症、阴茎异常勃起及转移性肿瘤等病变。造影方法：被检者仰卧，龟头部用橡皮胶围住并向下拉，固定在另一条围绕两侧大腿中部的绷带上，使阴茎垂直。阴茎皮肤常规消毒，局部用1%～2%普鲁卡因麻醉，穿刺部位为冠状沟下方或海绵体中部外上方，缓慢注入50%～60%碘溶液至两侧海绵体完全充盈，10～50ml，穿刺经过皮肤、浅筋膜、疏松结缔组织、深筋膜，进入海绵体。有时可同时显示阴茎根部静脉丛。一般在20min后造影剂全部吸收，此时可观察泌尿道显影。

5．前列腺造影 先行清洁灌肠，再消毒局部直肠，不用麻醉剂，直接从直肠前壁穿刺至前列腺两侧叶，分别注入70%的有机碘溶液，至腺体及包膜下充盈为止，20～40ml。充盈后摄正位及斜位片。为防止造影剂刺激前列腺发生水肿，特别是前列腺肥大者，可在造影后留置导尿管，并注意有无出血和感染。

6．精索静脉造影 可诊断静脉曲张，观察手术后疗效。常规消毒，局麻后暴露精索静脉，分离其中较大的一支，用注射器针头穿刺注入30%泛影葡胺10ml，快速推完，立即摄片，应包括盆腔，中心线对准腹股沟中点，或经右股静脉穿刺，将预成型导管送入左肾静脉后再插入左精索静脉内，快速注入76%的泛影葡胺10～15ml，每秒摄片1张，共4～5s。正常情况下精索内静脉及蔓状静脉丛因造影剂逆向充盈而显影，有时因静脉瓣存在，仰卧显示静脉范围较小，需采用半立位以增加显影机会。

7．淋巴造影 一般经足背下肢途径淋巴造影，可用于观察腹腔内淋巴结的病理改变，如睾丸及前列腺的恶性肿瘤转移，更直接方法为睾丸淋巴造影。常规阴囊及腹股沟皮肤消毒，局部麻醉，将1ml伊文思蓝注入睾丸内或0.1ml商品蓝注入壁层鞘膜内。切开阴囊上部腹股沟区暴露精索，在注射后15min染料进入精索旁淋巴管，一般能见到4～6支，部位较精索血管表浅并较下肢淋巴结粗大。选择其中最大一支，游离后插入27～30号细针，丝线结扎固定，缓慢注入碘油5ml，约每15min注入1ml。本法优点能直接见到精索淋巴管及引流淋巴结，补充下肢淋巴结造影的不足。

8．血管造影 男性生殖器官的血液供应主要来自直接起自腹主动脉的睾丸动脉，还有髂内动脉的分支，外阴部来自髂外动脉的分支。检查睾丸及附睾病变应做睾丸动脉造影，其他部位的生殖器官病变应做经髂内动脉造影。检查静脉曲张可做相应的静脉造影，右侧睾丸静脉造影经下腔静脉，左侧睾丸静脉造影经肾静脉。为增加显影机会，可采用直立位，使造影剂容易充盈较低位置的静脉。前列腺周围有较多的静脉丛，显示前列腺周围的静脉，可反映前列腺情况。数字减影血管造影是利用计算机处理数字化的影像信息，可清除骨骼及软组织影。

二、CT检查

CT检查可用于膀胱、前列腺、阴茎、睾丸、附睾和精索的检查。膀胱、前列腺检查前应充盈膀胱（保留尿液或注液）。患者取仰卧位后，扫描自耻骨联合下缘至膀胱上缘（髂前上棘水平）。必要时可行增强扫描。CT很少应用于阴茎的检查，多用于隐睾定位、睾丸、附睾肿瘤及其盆腔转移病变的检查。一般采用平扫和增强，扫描范围自附睾、睾丸的下界至耻骨联合，疑有盆腔和腹膜后淋巴结转移者，应扩大扫描范围。

三、MRI检查

MRI是目前影像学显示盆腔内脏器及其病变的最佳手段之一，可利用多方位切层来显示这些器官的解剖结构以及与周围脏器的关系。膀胱、前列腺、精囊检查时应中度充盈膀胱。一般常规做横断T1和T2加权扫描和冠状T1加权扫描，有的主张先做横、冠、矢3个方位的T1加权扫描，可根据患者不同情况和诊断要求，选择适当的扫描方位和序列。由于阴茎、阴囊和睾丸位于体表，某些病变易于诊断，很少应用MRI。如需检查务需注意扫描方位及体位的固定。阴茎检查在确保将阴茎固定于正中矢状位后，再行矢状位的T1和T2加权扫描。对睾丸及阴囊可采用横断、冠状或矢状的T1和T2加权扫描，必要时加做质子加权成像。最好选择表面线圈，获得的图像会更清晰。

四、与不育有关的主要疾病影像学特点

（一）精囊与精路疾病

1．精囊缺如 精路X线造影精囊不显影。CT平扫及强化后薄层扫描均未见精囊显示。MRI未发现精囊显示可确诊。但这几种方法均不如超声检查优势明显。

2．精囊炎 X线平片慢性精囊炎有时可见精囊及输尿管钙化，钙化呈管状及双轨样。精路造影，精囊不同程度的节段性扩张，或伴有囊内充盈缺损，多系积脓所致；精囊不充盈或充盈不全，管腔变细或缩短，边缘毛糙不整。射精管壶腹部边缘呈虫蚀样改变或轮廓不整，常可伴输精管或射精管闭塞，造影主要表现为管腔狭窄或闭塞。病变可为单侧或双侧。CT平扫显示精囊体积增大，形态饱满，密度减低，CT值常为20Hu左右。增强扫描常见精囊呈不均质强化，可见条状显著强化及不规则无强化的水样密度区。MRI表现为T1加权像，除可见精囊形态增大外，还可见精囊与周围脂肪组织的界面模糊。T2加权像表现为不均质高信号，有纤维组织增生或肉芽肿形成时可出现低信号区。

3．精囊结核 X线平片可见斑点状钙化影。精路造影精囊狭窄变细、变形，边缘呈锯齿状或绒毛样影，其内可见小的充盈缺损或洞腔。输精管壶腹和射精管可同时受累。CT可有不同的表现，其典型的表现为精囊体积缩小，形态不规则，密度欠均匀，内有散在的高密度钙化灶，强化后扫描呈不均质强化，其内示有不规则低密度无强化坏死区。MRI表现为精囊不规则增大或缩小，信号不均，其边缘与周围脂肪组织的界限模糊。T1加权像呈低信号，T2加权像可见高信号区。若有纤维化，T2加权像可见不规则低信号。注射Gd-DTPA后病灶可出现明显不规则强化。

4．精囊结石 X线平片表现为单个或多个结石的高密度影，结石一般较小，1～2mm，呈沙砾样，有的平片难以显示。较大的结石可达1～2cm，需与膀胱结石鉴别，主要采用精囊造影，采用低密度造影剂（15%有机碘溶液），结石位于精囊内，与造影剂存在显示密度不均，常伴精囊炎与输精管扩张。CT平扫示精囊内单个或多个大小不等的斑点状高密度灶，大小1～3mm，块状密度灶少见。MRI诊断结石较困难，结石在T1加权像和T2加权像均为低信号，多难以分辨。

5．精囊囊肿 X平片无阳性发现。精路造影可见精囊扩大，呈类圆形，其内可伴有沙砾样结石，且可发生位移。CT平扫显示精囊单侧或双侧囊性密度灶，边缘光滑，其内一般为水样密度，合并感染或出血时CT值可增高，增强扫描病灶呈环状薄壁强化，内容物无强化。MRI表现为规则的囊状病变，T1加权像为等或低信号，T2加权像为高信号。囊内含有精子和其他细胞等混合物的棕色液体，或由脂肪或其他未被检测出的有形成分时，精囊囊肿T1加权像和T2加权像均有高信号。

6．精囊肿瘤 X线平片可无阳性征象。精路造影显示精囊内有充盈缺损，边缘不规则。癌肿引起的精囊破坏易与对侧精囊形成瘘道。如无瘘道，对侧精囊可因肿瘤压迫而移位，射精管也可受压、移位或阻塞。尿路造影膀胱下缘可见压迹或抬高。CT平扫示精囊不规则增大，密度不均，周围脂肪间隙消失，增强扫描呈不均质强化，正常组织与瘤组织分界不清。MRI表现为精囊异常增大，形态失常，T2加权像患侧精囊信号较正常精囊之信号变弱。

7．精囊损伤 精囊造影可显示精囊管腔狭窄，边缘不整齐，有时则形成不规则扩大。严重者引起阻塞而不显影。

8．精路梗阻 精路造影可显示梗阻征象。

（二）阴茎疾病

1．阴茎纤维性海绵体炎 X平片可见小点状或斑点状钙化，钙化多位于阴茎背侧近冠状沟处。海绵体造影可显示结节病灶，海绵体本身可缩小变形及移位，海绵体间隔增厚。CT表现多为阴茎背侧涉及阴茎海绵体及白膜的低密度灶。有时病灶区可发现高密度钙化，并伴有低密度晕环，常可发现临床未能触及的病灶。

2．阴茎肿瘤 X线平片价值有限。血管造影可显示肿瘤的供应血管和异常血管。阴茎转移性肿瘤在海绵体造影时可见局部充盈缺损，边缘不规则。

3．血管性阳痿 阴茎动脉造影可显示动脉狭窄或闭塞。病变部位可发生在髂内动脉至阴茎动脉末梢分枝的任何水平，最常累及阴部内动脉和阴茎深层背动脉，大多为双侧病变。大血管腹壁下动脉或阴部内动脉狭窄或闭塞，腹壁下动脉末梢区域出现侧支循环，阴茎动脉不显示。确定动脉性阳痿关健是双侧血管明显闭塞。如果仅为单侧不显影，来自对侧的侧支循环足以使不显影侧再通。静脉海绵体造影可显示阴茎异常静脉回流或静脉瘘。异常静脉回流和静脉瘘的部位和方式有以下几种：背深静脉瘘正位片示前列腺膀胱周围静脉丛和盆腔内静脉显影，斜位片示阴茎背深静脉显影并迂曲延伸至前列腺静脉丛；海绵体间漏正位片前列腺静脉丛显影；阴茎脚静脉漏正位片见周围静脉丛、脚部静脉显影，斜位片见阴茎脚处1～3条静脉显影并迂曲引向盆腔内血管；阴部外静脉漏阴茎根部外侧一条显影，走向周侧大腿根部，有时可见大隐静脉同时显影。

（三）精索病变

1．精索炎 精路X线造影可见输精管精索段狭窄或闭塞，近端扩张，狭窄段边缘毛糙，病变范围较广泛。

2．精索静脉曲张 选择性精索静脉X线造影可显示精索内静脉迂曲、扩张及反流，诊断标准为精索内静脉全部充盈为重度扩张，部分充盈为轻度扩张。CT检查于精索的走行区域及睾丸的后下方见不规则的葡萄串状低密度影，与腹股沟相连。增加腹压后病灶区域增大，反之则病灶复原，增强后病灶明显强化。

3．精索肿瘤 有良性脂肪瘤与恶性横纹肌肉瘤，均表现为CT检查精索区软组织肿块影。脂肪瘤为脂肪密度，边界清楚，恶性肿瘤则不均匀，边界模糊，增强后呈不均匀强化。

（四）睾丸附睾疾病

1．隐睾或睾丸下降不全或无睾 于睾丸下降行程部位如腹膜后、腹股沟管及阴囊入口等处CT检查发现软组织密度肿块影，一般呈圆形或椭圆形，边界光整，与周围组织分界清，内部密度均匀。MRI是敏感而可靠方法，T1加权像正常睾丸呈卵圆形低信号，在短T1的高信号脂肪衬托下可见长条状精索及流空血管。睾丸包膜在T1加权像、质子密度像及T2加权像均呈致密纤维低信号环状影。T2加权像脂肪信号低，睾丸呈长T2高信号，信号均匀。如果在睾丸下降部位未发现睾丸，即应考虑异位睾丸或无睾可能，注意检查前腹壁、股三角、腹膜与阴茎根部等。

2．睾丸炎 CT表现为睾丸内密度尚均匀，部分伴鞘膜积液。如为肉芽肿性睾丸炎则睾丸呈不均匀增大，边缘不整，内部密度不均，并可见坏死囊变区。MRI表现在T2加权像呈不均匀低信号，难以与肿瘤区分，T1加权像对睾丸炎不敏感，仅见睾丸体积增大，信号不均匀。

3．睾丸结核 CT表现为睾丸普遍增大或局部肿大，内部呈软组织密度，边缘可不清晰。如有脓肿形成及纤维增殖钙化时，内部密度不均，可显示斑点状甚至高密度的钙化影。部分因睾丸鞘膜内积液而呈液性低密度。MRI表现无明显特异性，T1加权像多表现为低信号，可不均匀；T2加权像主体仍呈低信号，但内部信号不均匀，可见斑点状高信号灶。病变较大时睾丸可有不同程度增大，形态不规则，边缘不光滑，患侧常伴少量积液。

4．睾丸肿瘤 畸胎瘤X线片可发现骨骼或牙齿影，少数精原细胞瘤在软组织摄影中可见细小钙化点。恶性睾丸肿瘤易发生腹膜后淋巴结或其他部位腹腔内转移，检查可用血管造影或淋巴造影。CT检查精原细胞瘤肿块一般呈软组织肿块密度，边缘清楚，密度大多不均匀，肿块内可见不规则低密度坏死区，部分可出血，少数病灶可见分隔，增强后肿块实质部分均有不同程度强化，低密度区不强化，强化后肿瘤更不均匀。睾丸畸胎瘤睾丸肿大，边缘清楚，密度一般不均，少数可均匀，内见不规则更低密度区，增强后肿块轻度强化，低密度区强化不明显。睾丸胚胎癌及其他肿瘤，边界尚清，密度不均，内见低密度区，增强后强化，低密度区则不强化。MRI检查，睾丸精原细胞瘤可清晰显示精原细胞瘤及其周围正常组织，瘤体信号轻度不均。在T2加权像病灶信号较邻近正常组织及阴囊液体的信号低，纤维化时为低信号，若并发出血则出现各期出血信号特点。睾丸畸胎瘤MRI为睾丸不规则增大，T1加权像呈不均匀略低信号，T2加权像呈高或低信号，多以低信号为主，有时可显示低信号包膜。睾丸其他肿瘤MRI表现大致相等，在T1加权像、质子加权像及T2加权像上信号强度均较正常睾丸组织信号低。

5．附睾炎 CT检查附睾弥漫或局限性增大，尤以尾部局限性增大为多。内部为软组织密度区，增强后病灶呈不均匀强化。睾丸鞘膜内可见积液的液性密度。MRI检查附睾增大，部分患者信号可正常，信号比睾丸略低。另一些患者不均质或信号比正常强。慢性附睾炎信号较低。

6．附睾结核 附睾X线造影显示输精管多发性狭窄或阻塞，附睾常不能充盈或呈不规则扭曲和充盈缺损，或有瘘道。CT表现为附睾弥漫或局限性增大，多是尾部增大，平扫密度可不均匀，结节状低密度区内可见斑点状钙化影，增强后病灶区呈不均匀强化。MRI检查，病变由肉芽组织、纤维组织和干酪样成分构成，T1加权像多表现为低信号，T2加权像主体仍呈低信号，但内部信号不均，可见斑点状高信号灶。当病变较大时睾丸可有轻度的受压改变，病灶不规则，边界不光滑，患侧常有少量鞘膜积液。

（五）前列腺疾病

1．前列腺炎 X线平片上慢性前列腺炎可见到前列腺结石或斑点状钙化。尿道造影可显示后尿道延长、平直，造影剂进入扩张的腺体分泌小管而显影，在精阜两侧呈发射状或树枝状影。前列腺炎常无特异的CT表现，部分患者平扫前列腺体积略大，形态饱满，密度略低，CT值20～30Hu，增强扫描呈轻度强化，其内见分布不均的斑点状强化区。MRI检查无特异性。慢性前列腺炎以T2加权像敏感，可表现信号杂乱，不均匀，高信号区内常可见更长T2信号灶，代表假囊肿病灶。T1加权像对前列腺炎不如T2加权像敏感，但可表现为信号不均匀。急性前列腺炎信号不均匀，以T2加权像敏感。

2．前列腺脓肿 脓肿向膀胱或后尿道破溃时，膀胱或尿道X线造影可见造影剂进入前列腺脓肿腔内。CT平扫示前列腺体积增大，形态不规则，内见单个或多个大小不等、边缘尚清的低密度灶，CT值15～25Hu，增强扫描低密度灶，呈轻度环状周边强化，中央无强化。MRI可清晰显示前列腺脓肿，且多方位切层可用于引导外科引流术，前列腺信号不均匀，形态失常。

3．前列腺结核 X线平片可见结核钙化影，多呈斑点状，病灶边缘不规则者难与前列腺癌鉴别。尿道造影显示后尿道变窄，边缘不规则，可见脓疡及瘘道形成，若与尿道相通，造影剂可进入其内而显影。CT典型者前列腺体积略大或缩小，边缘凹凸不平，内常见多个大小不等的不规则低密度坏死区，常伴有斑点状钙化，增强扫描前列腺呈不均匀强化。MRI检查，结核病灶较小时在形态、大小可无异常，较大的病灶可致形态改变、体积增大。MRI显示前列腺结核较为理想，T1加权像呈低信号，T2加权像可呈高信号，信号可不均匀，与正常组织分界不清；若病灶有干酪坏死则信号不均匀，在T1加权像可见高信号区；若有纤维化则T2加权像可见不规则低信号。

4．前列腺结石 X线平片检查前列腺结石几乎全部为阳性结石，常表现在耻骨联合下区、距中线1～3cm范围内有大小不等、弥漫分布或对称性以及马蹄形分布的致密阴影。前列腺增生时其上部结石可高出耻骨联合，需与膀胱结石鉴别。CT扫描显示多发散在或群集分布的斑点状、块状或弧形高密度灶，高密度灶多较小，一般＜5mm。由于前列腺结石不含自由水，MRI在T1及T2加权像均无信号。

5．前列腺囊肿 膀胱尿道X线造影可发现后尿道有受压移位，膀胱底部抬高。输精管精囊造影则可见一侧或两侧精囊和输精管壶腹部受压呈弧形移位。CT检查前列腺内边缘清晰光滑、整齐的水样密度灶，CT值10Hu左右。病灶与正常腺体组织界限清晰，增强扫描无强化。所有前列腺囊肿表现基本相同，在T1加权像为均匀低信号，T2加权像为均匀高信号，与尿液信号强度相似，内部结构均匀，边缘锐利，囊壁菲薄，MRI不易显示。先天性囊肿多位于中线处，苗勒管囊肿多位于精阜之上，可向上超出前列腺的轮廓。潴留囊肿及其他继发性囊肿多发生在前列腺的外侧部。

第九节 微生物学检查

男性生殖道感染可从精液检出微生物，包括细菌、支原体、病毒和原虫等。常见的病原微生物有金黄色葡萄球菌、链球菌、淋病奈瑟菌、大肠埃希菌、类白喉杆菌、解脲支原体等。若炎症部位有较多的上皮细胞脱落，还可在细胞内查沙眼衣原体包涵体、单纯疱疹病毒及巨细胞病毒包涵体等。据报道由生殖道感染所致不育症发病率比非感染不育症高4倍。

一、标本采集

1．尿道分泌物 清洗尿道口，尿道口用灭菌纱布或棉球擦拭，采取从尿道口溢出的脓性分泌物或用白金耳棉拭子插入尿道内2～4cm取出分泌物。如无脓液溢出，可从阴茎的腹面向龟头方向按摩，促使分泌物溢出。

2．前列腺液 用前列腺按摩法采集前列腺液。清洗尿道口，冲洗尿道、膀胱，从肛门用手指按摩前列腺，使前列腺液溢出，用无菌容器收集。

3．精液 受检者应5d以上未排精，清洗尿道口，采用手淫法或体外排精法取精，置于灭菌容器内送检。

4．溃疡分泌物 先用生理盐水清洗患处，用灭菌棉拭子取其边缘或基底部的分泌物，置于灭菌试管内送检。

二、检查方法

检查方法有涂片检查、分离培养、免疫学方法、分子生物学方法、药物敏感试验等内容，详见第二章第六节“微生物学检查”。