第九节　定量检验方法的选择、验证和确认程序

1　目的

规范定量检验方法的选择程序，对选用的定量检验方法采用同行公认的验证或确认方法进行评审，以保证所选用的定量检验方法和检验程序能满足临床和患者的需求，确认其符合相应的用途。

2　适用范围

实验室开展的检测项目。

3　职责

3.1 技术主管和各专业组组长负责检验方法的选择。

3.2 各专业组组长负责组织和实施本组所选方法的验证确认。

3.3 技术主管负责审核方法验证确认结论。

3.4 检验科主任批准方法验证确认结论。

4　定义和术语

通过提供客观证据对规定要求已得到满足进行认定。

通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足进行认定。

简称标准方法，是指卫生标准、技术标准或检测工作规范中明确规定必须采用的检测方法，并具有检测方法名称和标准文号。

指卫生标准、技术标准和检测工作规范中未明确规定而可以由检测机构自行选择的检测方法。非标准方法可以是权威机构发布的方法，或有关科技文献、杂志、教科书上发表的方法。

检验科根据工作需要而设计开发的检测方法。

可检测的最低分析物浓度为检测系统的分析灵敏度（或称检测限）。

样品单次检测可以达到的非空白检测响应量对应的分析物量。

某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量，该样品内含有的分析物浓度或其他量值为生物检测限。

以天间重复CV为20%时对应检测限样品具有的平均浓度，确定为检测系统或方法可定量报告分析物的最低浓度或其他量值的限值。

广义上是某一物质对某分析物的浓度或催化活力测定中任何一步骤的影响作用。

依据所有参考值的分布特性以及临床使用要求，选择合适的统计方法进行归纳分析后，确定参考值范围中的一部分为参考区间。

5　工作程序

5.1 检测方法的选择

5.1.1 检验科应采用满足服务对象需要并适用于所进行的项目的检测方法。

5.1.2 当服务对象未指定所采用的方法时，检验科应优先选择标准检测方法。若无标准检测方法，检验科应首先使用体外诊断医疗器械使用说明中规定的程序（方法），公认/权威教科书、经同行审议过的文章或杂志发表的，国际公认标准或指南中的，或国家、地区法规中的程序（方法）。如果应用的是内部的规程，则应确认其符合相应的用途并形成文件。

5.1.3 检验科所采用的检测方法应保持最新有效版本，并现行受控。

5.2 检验程序（方法）的验证

在常规应用前，应由检验科对未加修改而使用的已确认的检验程序（方法）进行独立验证。从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。通过获取客观证据（以性能特征形式）证实检验程序的性能与其声明相符。验证过程证实的检验程序的性能指标，应与检验结果的预期用途相关。

对于配套检测系统，检验科可采用来自于厂家信息或公开出版的相关性能的指标，但原则上至少验证这些外部数据的正确度（准确度）、精密度和可报告范围，对于低值在临床上特别有用的项目（如:促甲状腺激素等）还需做灵敏度分析。

某些情况下，某些试验可能会间歇性地执行，或者是短时间执行（如科研性的检测项目或者是与季节病有关的检测如流感病毒抗原等），对于这些检测，实验室应该在方法投入使用前就对其性能进行验证，并且，在停止检测一段时间后，若需再检验，应对其不准确度（不正确度）、不精密度进行评估，当适用时，还应对其他性能进行验证。

5.3 检验程序（方法）的确认

检验科应对以下来源的检验程序（方法）进行确认:

a）非标准方法；

b）检验科设计或制定的方法；

c）超出预定范围使用的标准方法；

d）修改过的确认方法。

方法确认应尽可能全面，并通过客观证据（以性能特征的形式）证实满足检验预期用途的特定要求。检验程序（方法）的性能特征宜包括:测量正确度、测量准确度、测量精密度（含测量重复性和测量中间精密度）、测量不确定度、分析特异性（含干扰物）、分析灵敏度、检出限和定量限、测量区间、诊断特异性和诊断灵敏度。

对于非配套检测系统，适用时，必须建立正确度（准确度）、精密度、分析灵敏度、干扰和可报告范围　［如分析测量范围（AMR）和临床可报告范围（CRR）］。关于干扰的数据，当适用时可从厂家获得或者是公开发行的文献获得。

5.4 精密度核实实验操作要点和要求

5.4.1 做精密度实验用的样品一定要稳定；它的基质组成应尽可能与实际检测的患者标本相似；样品中的分析物含量应在该项目的医学决定水平处，或者在有临床意义的水平。有可能的话，做2个水平的精密度实验。可以使用的样品包括控制品（必须和实验中进行每天质量控制用的控制品是两组不同的样品）、校准品、已经检测过的患者标本或具有血清基质的定值材料。

5.4.2 如果对配套的检测系统作实验证实或核实，则选取的样品分析物含量应尽量与公司对检测系统进行性能评估时采用的含量一致，以便于比较。

5.4.3 采用冷冻保存的样品一定要注意内含分析物的稳定性和瓶间差，要严格控制每次复溶冻干品时使用的复溶液的质量、开瓶要小心谨慎、加液准确、控制使冻干块浸润并复溶的时间，注意混匀的操作手法等。

5.4.4 实验时按照厂商操作规程的要求做好校准，常规进行室内质量控制，每次实验时，只使用在控的数据为核实实验的原始资料。出现失控时，必须重做核实实验。

5.4.5 核实实验安排20天，每天做2个浓度水平。批内是将评价样品随机插入患者标本中进行检测，一批内连做20次；天间是每天做一次评价样品，累积20次结果。

5.4.6 收集实验数据，计算均值、标准差和变异系数。从质量目标中查阅该项目允许误差范围并做出评价。未有质量目标的项目由技术管理层负责设置。小于或等于判断限的，检测系统的不精密度属可接受；大于判断限的，表示不精密度不符合要求。

5.4.7 如果在一个分析系统上可以做多个项目的检测，用一个项目组成的检测系统的评价资料，代替所有项目检测系统的性能不恰当。

5.4.8 根据工作需要，也可选择其他评价/验证的方法，如CLSI EP5文件等。

5.5 正确度核实实验操作要点和要求

检验科在用一个新的检测系统或测定方法（或新试剂盒、新仪器）进行患者标本测定前，应与原有的检测系统或公认的参考方法一起检测一批患者标本，从测定结果的差异了解新检测系统或方法引入后的偏移。如果偏移在允许的误差范围内，说明新检测系统或方法替代原有检测系统或方法不会对临床结果引起明显偏移。通过比对试验进行正确度核实实验的操作要点和要求参照“检验结果可比性管理程序”。根据工作需要，也可选择其他评价/验证的方法，如CLSI EP15-A2、EP9-A3等文件。

5.6 线性范围确认实验操作要点和要求

5.6.1 实验操作要点与要求

5.6.1.1 进行线性范围确认实验的样品必须与真实标本尽可能相似，也要与真实标本具有相同的基质状态。

5.6.1.2 最好有5个或以上的系列浓度的实验样品，浓度范围遍及整个预期可报告范围。最高浓度的样品应达到可报告范围的上限。各实验样品内分析物浓度呈等比例关系，不要呈倍比关系。

5.6.1.3 若能收集到含低浓度分析物的患者样品（如血清），将外观澄清的混合样品离心，一分为二。在一份混合样品中加入高浓度分析物贮存液，加入体积不得超过混合样品体积的1/10，但又可使样品中分析物浓度达到高限，充分混匀后为高值（H）样品。在另一份混合样品中加入配制分析物贮存液的溶剂，加入量等于前一份样品中加入贮存液的体积，充分混匀后为低值（L）样品。将H和L样品按:5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H关系各自配制混合，形成系列评价样品。

5.6.1.4 若收不到低值样品，可收集高值样品，用生理盐水/蒸馏水作不同程度稀释，形成系列评价样品。

5.6.1.5 一天内做两次实验，综合所有结果作统计学处理。

5.6.2 判断线性范围的统计处理

5.6.2.1 检测系统或测定方法经校准后，对线性范围实验的低、高限值样品做多次测定，以均值表示该2个样品测定结果。依照配制稀释关系，可以计算出其他线性范围实验样品内含分析物的浓度，为这些样品的预期值。将这些样品再经检测系统或测定方法检测，得到各实测值。

5.6.2.2 在Excel电子表格或其他统计工具上，以X表示各样品的预期值，以Y表示各样品的实测值，将所有实验结果输入画图统计。

5.6.2.3 若所有实验点在坐标图上呈明显直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若b在0.97～1.03范围内，a接近于0，则可直接判断测定方法可报告范围为实验涉及的浓度范围；若b不在0.97～1.03范围内，a较大，试着舍去某组数据，另作回归统计。若缩小分析范围后，回归方程满足b接近于1，a趋于0的条件，则缩小的分析范围是真实的可报告范围。

5.6.2.4 斜率b和截距a也可直接进行统计参数估计分析。

5.6.2.5 根据工作需要，也可选择其他评价/验证的方法，如CLSI EP6-A指南、平均斜率法等。

5.7 分析灵敏度评价实验操作要点和要求

5.7.1 分析灵敏度分为具有定性含义的检测低限和具有定量含义的生物检测限及功能灵敏度。

5.7.2 空白样品的准备:理想的空白样品应具有与被检标本相同的基质。通常使用检测系统的系列校准品中的 “零标准”作为空白。对某些项目，可使用特殊的患者样品（如前列腺肿瘤术后患者的无PSA血清）为空白样品。

5.7.3 检测限样品的准备:在证实某方法的灵敏度性能时，在空白样品中加入分析物配制成检测限样品。加入分析物的量应是厂商声明的检测限浓度。在建立检测限度时，根据需要有必要制备多份检测限样品（如6份或更多），各检测限样品内分析物浓度呈倍比关系或等比例关系。它们的浓度应介于预期检测限度高/低一些的范围内。

5.7.4 重复检测次数:没有具体规定，常推荐做20次，符合临床检验对重复检测实验的要求。厂商常推荐10次，目的为减少开支，检验科也可采纳做10次。

5.7.5 实验需要的时间:如果主要从空白样品的重复性了解检测低限，常常做批内或短期实验。如果主要从 “检测限”样品的重复性了解定量的检测限，推荐作较长时间的实验，代表天间检测性能。实际可做10次或20次检测（10天或20天）。

5.7.6 求检测低限（LLD）:将空白样品重复20次（不低于10次）作批内测定，计算空白（响应量）均值（_空白）和标准差（S_空白）。通常估计95%或99.7%两种可能性。95%可能性为:LLD=_空白+2·S_空白；99.7%可能性为LLD=_空白+3·S_空白。如果该方法在测定范围内测定物质与吸光度间呈线性，则可求出LLD浓度。检测系统或方法对小于或等于检测低限的分析物量只能报告 “无分析物检出”。求生物检测限（BLD）:对多个近于检测限浓度的样品（肯定不是空白样品）作天间重复检测20次（不低于10次），计算扣除空白响应量后的样品检测响应量的均值（A）、标准差（S_{检测限样品}）和变异系数（CV）。按正态分布规律，95%的BLD可能性为:BLD=LLD+2·S_{检测限样品}；99.7%的BLD可能性为:BLD=LLD+3·S_{检测限样品}。例如，计算某方法检测某物质99.7%可能性的生物检测限，由低浓度向高浓度逐个计算差值（A-3·S_{检测限样品}），直至第一个低浓度样品的差值（A-3·S_{检测限样品}）＞3·S_空白，则该浓度为该方法检测该物质的BLD。

5.7.7 求功能灵敏度（FS）:根据多个近于检测限浓度的样品做天间重复检测时扣除空白响应量后的样品检测响应量变异系数（CV），从中选择具有或最近于20%CV的对应浓度，即为FS。

5.7.8 根据工作需要，也可选择其他评价/验证的方法，如CLSI EP-17等。

5.8 分析干扰评价实验操作要点和要求

5.8.1 第一种方法:将阳性干扰物加入临床样本的混合液（干扰测定样品）中，与不加的同一混合液（干扰对照样品）组比较有无偏移，称为 “配对差异”试验。混合液的干扰物浓度应处在临床决定水平处，根据分析物情况应做几个临床决定水平浓度处的实验。一般最有效的方法是在较高浓度下对一系列可能的干扰物作初步筛选。如果临床意义不显著，则该物质不是干扰物，没有必要做进一步实验。反之，具显著临床意义的，应进一步作评价以确定干扰物浓度与干扰程度间的关系，这类实验称为“剂量响应”系列。第一种人为加入方法的局限性有:在临床样本中的真实干扰物可能不是原来的药物，而是代谢产物；实验标本基质并不代表典型的有问题的临床样本；加入的物质与临床样本中的干扰物不相同，例如，蛋白结合、沉淀，或不均一性（异质性）；可能实验浓度水平选择得太高或太低以至于不真实。

5.8.2 第二种方法:从被选择的患者标本组中寻找不准确的结果。选择原则:①疾病（例如，来自心脏病、肝病或肾病患者的样本）；②药物（例如，使用过某种想了解的药物的患者标本）；③其他异常组分（例如，具异常胆红素、脂质、血红蛋白或蛋白的标本）；该方法需要参考方法，即具良好特异性的方法，以确定比较研究中的“真值”。第二种方法的局限性主要是对实验变异缺乏控制对照:本方法并不能确定原因与作用的关系，它只能说明偏移与估计某水平的干扰物的相对关系；如果标本不新鲜，将会失去某些易变组分（例如，乙酰乙酸）；患者通常用多种药物，因此，难于证实某药物的干扰作用；按疾病和用药对患者分类，不是不可能，至少对许多实验而言非常困难；实验是一种机遇，成功取决于检测的患者人群标本中是否有此干扰存在；很少有公认的参考方法，有的参考方法难以在常规实验室中使用，另外，参考方法可能也存在同样的分析干扰。

5.8.3 以上两种方法评价检测系统或分析方法的抗干扰能力都有内在局限性，建议一起使用以相互补充。第二种方法是唯一可检出药物代谢物干扰作用的方法，它也是可肯定在真实标本中有干扰的一种方法。

5.8.4 根据工作需要，也可选择评价携带污染或其他评价/验证的方法，如CLSI EP-7等文件。

5.9 参考区间评价实验操作要点和要求

当检验科用一个新的检测系统或新的测定方法测定患者样本，如果检验科有理由相信某一特定参考区间对参考人群不再适用，则需对生物参考区间进行评审。参考区间评价实验操作要点和要求参照《生物参考区间评审程序》。

5.10 检验科对商品定量试剂盒分析性能的验证可参考WS/T 420—2013《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》。

5.11 各专业组记录验证和确认结果。当对确认过的检验程序进行变更时，应将改变所引起的影响文件化，适当时，应重新进行确认。

6　支持性文件

LAB-PF-031《检验结果可比性管理程序》

LAB-PF-028《生物参考区间评审程序》

LAB-PF-025《定性检验方法的选择、验证和确认程序》

WS/T 420-2013《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》

LAB-SOP-003《定量检测系统的分析性能及其评价方法作业指导书》

检验科质量目标

7　质量记录

检测系统性能验证报告