2.5　实验内容

2.5.1　差值吸收光光度法测定废水中的微量苯酚

实验目的

（1）学习使用UV-1801紫外-可见分光光度计。

（2）掌握差值吸收光光度法测定废水中的微量苯酚的方法。

实验原理

酚类化合物在酸、碱溶液中发生不同的解离，使其溶液的吸收光谱发生变化。苯酚在紫外区有两个吸收峰：在酸性或中性溶液中，λ_max为210nm和272nm；在碱性溶液中，λ_max位移至235nm和288nm。在紫外-可见分光光度法分析中，利用在不同的酸、碱条件下，苯酚溶液吸收光谱变化的规律，直接对有机化合物进行测定。

废水中含有多种有机杂质，这会干扰苯酚在紫外区的直接测定。如果将苯酚的中性溶液作为参比溶液，测定苯酚碱性溶液的吸收光谱，利用两种光谱的差值光谱，有可能消除杂质的干扰，实现废水中苯酚含量的测定。这种利用两种溶液中吸收光谱的差异进行测定的方法，称为差值吸收光谱法。

仪器与试剂

（1）仪器　岛津UV-1801紫外-可见分光光度计；容量瓶（50mL容量瓶10个）。

（2）试剂　苯酚标准溶液（准确称取苯酚0.300g，置于1L容量瓶中）。

实验步骤

（1）配制苯酚的标准系列溶液：将10个50mL容量瓶分成两组，各自编号。按照表2-2加入相应的溶液，再用水稀释至刻度，摇匀，作为苯酚的标准系列溶液。

（2）绘制苯酚的吸收光谱：取上述同一编号的两组溶液，用1cm吸收池，以水作参比溶液，分别绘制苯酚在中性溶液和碱性溶液中的吸收光谱。然后用中性的苯酚溶液作参比，绘制苯酚在碱性溶液中的吸光度差值光谱。

（3）测定苯酚两种溶液的光谱差值：从上述绘制的差值光谱中，选择288nm附近最大吸收波长作为测定波长。在UV-1801紫外-可见分光光度计上固定λ_max，然后成对地测定苯酚溶液两种光谱的吸光度差值。

（4）未知试样中苯酚含量的测定：将6个50mL容量瓶分成两组，每组3个，分别加入未知样。将其中3个用去离子水稀释，其余3个加入2.5mL KOH溶液，再用去离子水稀释至刻度，分别摇匀。将两组溶液分成3对，用1cm吸收池测定光度差值。

数据处理

（1）将表2-2中测得的光谱差值，绘制成吸光度-浓度曲线，计算回归方程。

（2）利用所得曲线或回归方程，计算未知样品中苯酚含量（用mol/L表示）的置信范围（置信度为95%）。

（3）计算苯酚在中性溶液（272nm附近）或碱性溶液（288nm附近）中的表观摩尔吸光系数。

思考题

（1）绘制苯酚在中性溶液、碱性溶液中的吸收光谱和差值光谱时，应如何选择参比溶液？

（2）在苯酚的差值光谱上有两个吸收峰，本实验采用288nm测定波长，是否可以用235nm波长作测定波长？为什么？

2.5.2　加和法多组分混合物的同时测定

实验目的

（1）掌握分光光度法吸光度的加和性原则，同时测定两组分的方法。

（2）掌握分光光度法测定摩尔吸光系数的方法。

实验原理

当体系中有几个组分时，根据吸光度的加和性，体系总吸光度为各组分吸光度之和。

　　（2-6）

式中，A_总为各组分吸光度A_i之和；c_i、ε_i分别为i组分的浓度和摩尔吸光系数。各组分的吸收光谱即使部分重叠，只要服从吸收定律，就可根据式（2-6）测定混合物中各组分的含量。

例如，在试样中含有两个组分x和y，其浓度分别为c_x和c_y，在波长λ₁和λ₂下，测得总吸光度和。根据式（2-6），可以得出以下方程组：

　　（2-7）

式中，、、、为波长在λ₁和λ₂时，组分x和y的摩尔吸光系数，可从已知浓度的纯组分溶液获得。解上述方程组，可求得c_x和c_y。用这种方法，原则上可以同时测定多组分混合物中各组分的含量，但组分增多，误差增大。

仪器与试剂

（1）仪器　UV-1801紫外-可见分光光度计；容量瓶（50mL容量瓶8个）。

（2）试剂　Co（NO₃）₂标准溶液（0.350mol/L）；Cr（NO₃）₃标准溶液（0.100mol/L）；Co和Cr混合试样。

实验步骤

（1）分光光度法同时测定两组分混合物的组成。

配制溶液：在4个50mL容量瓶中，分别加入2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL的Co（NO₃）₂标准溶液。

另取4个50mL容量瓶，分别加入2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL的标准溶液。分别用去离子水稀释至刻度，摇匀。

（2）绘制Co（NO₃）₂及Cr（NO₃）₃标准溶液的吸收光谱。

用1cm吸收池，以蒸馏水作参比溶液，在可见光区绘制上述各容量瓶中溶液的吸收光谱。

（3）混合试样吸收光谱：用1cm吸收池，用蒸馏水作参比溶液，绘制混合试样的吸收光谱。

数据处理

分光光度法的数据处理：根据Co和Cr的吸收光谱，确定λ₁和λ₂；计算Co和Cr的4种标准溶液在λ₁和λ₂处的ε值，求出Co和Cr的和，按式（2-7）计算混合物中两组分的浓度。

思考题

（1）分光光度法中，两组分同时测定时，如何选择测定波长λ₁和λ₂？

（2）两组分同时测定时，如何获得、、、？

2.5.3　双波长紫外分光光度法测定复方新诺明的主要成分

实验目的

（1）掌握双波长紫外分光光度法的测定原理。

（2）学习双波长等吸收点紫外分光光度法测定二元混合组分的方法。

（3）学习药物片剂的试样制备方法。

实验原理

经典分光光度法的定量测定通常是在被测组分的最大吸收波长处进行，根据朗伯-比尔定律，其吸光度值与被测组分的浓度c成正比，A=εbc。

当吸收光谱重叠的两个组分共存时，如何在测定被测组分时，可完全消除另一组分的干扰，达到共存组分不分离进行定量测定的目的。通常采用的方法有双波长法、三波长法、导数光谱法、差谱分析法等。其中双波长法中的等吸收双波长法应用较为广泛，该法的准确度和精密度要高于其他方法，是对共存组分不分离定量测定的有效方法之一。

等吸收波长法的一个典型应用实例是被收载于《中华人民共和国药典》中的抗菌消炎药复方磺胺甲唑片的含量测定。复方磺胺甲唑片中含有磺胺甲唑（SMZ）和甲氧苄啶（TMP）两种主要成分，其吸收曲线见图2-2。当测定SMZ时，选择其最大吸收波长257nm为测定波长，可以在干扰组分TMP的光谱曲线上304nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰；当测定TMP时，选择239nm为测定波长，可以在干扰组分SMZ的光谱曲线上295nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰，分别对SMZ和TMP进行含量测定。

图2-2（a）在0.1mol/L NaOH介质中，SMZ在257nm处有最大吸收；TMP在257nm处吸收最小，表明在0.1mol/L NaOH介质中测定SMZ时，TMP在波长257nm处干扰最小。

仪器与试剂

（1）仪器　UV-1801紫外-可见分光光度计；50.0mL容量瓶（7个）；2.0mL移液管（3支）。

（2）试剂　SMZ标准储备液（500mg/L，乙醇溶液）；TMP标准储备液（100mg/L，乙醇溶液）；0.1mol/L NaOH溶液；0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液；95%乙醇；复方磺胺甲唑片。

实验步骤

（1）试样制备。取复方磺胺甲唑片10片，精确称量后计算平均片重。将10片药片全部置于研钵中研细后，精确称取适量药片的粉末（约相当于SMZ50mg，TMP10mg）于一小烧杯中，用乙醇溶解后转移至100mL容量瓶中，用乙醇定容，摇匀。超声15min，过滤，弃去最初的20mL滤液，收集剩余滤液于干燥的50mL容量瓶中，作为供试溶液备用。

（2）磺胺甲唑的测定。准确移取上述供试溶液0.1mL于50mL的容量瓶，用0.1mol/L NaOH稀释至刻度，摇匀，作为SMZ待测溶液。

准确移取SMZ标准储备液、TMP标准储备液各1.00mL分别于两个50mL容量瓶，用0.1mol/L NaOH溶液定容，分别作为SMZ标准对照溶液Ⅰ和TMP标准对照溶液Ⅰ。

将TMP标准对照溶液Ⅰ置于石英比色皿中，用0.1mol/L NaOH溶液作参比，以257nm为测定波长（λ₁），在304nm波长附近，每隔0.2nm选择等吸收点波长（λ₂），要求。然后，将SMZ标准对照溶液Ⅰ置于石英比色皿中，分别在λ₁和λ₂处测定吸光度，求SMZ标准对照溶液Ⅰ在两波长的吸光度差值：

　　（2-8）

同法测得片剂待测溶液Ⅰ在两波长的吸光度差值。用下式求得片剂中SMZ的含量：

　　（2-9）

式中　——SMZ标准对照溶液Ⅰ中SMZ的质量浓度，mg/mL；

m₀——平均片重的粉末试样量，g；

m——制备供试液时所称的粉末试样量，g；

D——稀释倍数。

（3）甲氧苄啶含量的测定。准确移取上述供试溶液0.3mL置于50mL的容量瓶中，用0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为TMP待测溶液Ⅱ。准确移取SMZ标准储备液、TMP标准储备液各2.00mL分别于两个50mL容量瓶，用0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液定容，摇匀，分别作为SMZ标准对照溶液Ⅱ和TMP标准对照溶液Ⅱ。

将SMZ标准对照溶液置于石英比色皿中，用0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液作参比，以239nm为测定波长（λ₃），在295nm波长附近，每隔0.1nm选择等吸收点波长（λ₄），要求：

　　（2-10）

然后，将TMP标准对照溶液Ⅱ置于石英比色皿中，分别在λ₃和λ₄处测定吸光度，求TMP标准对照溶液Ⅱ在两波长的吸光度差值：

　　（2-11）

同法测得片剂待测溶液在两波长的吸光度差值。用用下式求得片剂中TMP的含量：

　　（2-12）

式中　——TMP标准对照溶液Ⅰ中TMP的质量浓度，mg/mL；

m₀——平均片重的粉末试样量，g；

m——制备供试液时所称的粉末试样量，g；

D——稀释倍数。

思考题

（1）在选择测定波长和参比波长时，除了应使干扰组分外，对于测定组分来说应注意什么？

（2）为什么在制备供试液时要在混匀后再称少量粉末而不是1片复方磺胺甲唑片剂研成粉末后直接制备？