第二节　水环境附着生物的研究方法

过去100多年里，附着生物生态学的发展非常迅速，出现了比较新的概念如附着生物景观，它推动了传统过程与大尺度景观生态学的结合，当然也可在微米或毫米尺度应用于附着生物景观（Battin et al，2007）。过去30年中，附着生物生态学和研究技术的发展是并驾齐驱的，如微电极和光纤技术的出现，使研究者可在附着层内进行精细的生物地球化学剖面研究（K¨uhl ， Polerecky，2008）。声学和光学速度计技术可用来描述附着生物群落附近和内部的水力条件、去向和来自附着生物的边界层运输（Larned et al，2004）。共焦激光扫描显微镜通过使在精细尺度上研究完整的附着生物结构成为可能影响了附着生物-景观研究（Larson，Passy，2005）。20世纪80年代，脉冲-振幅荧光计（pulse-amplitude modulated，PAM）允许生态学家原位测定附着生物群落的光合作用。PAM荧光仪在附着生物生态学中的应用非常多样，从毒理学到光和养分限制（Vopel，Hawes，2006；Muller et al，2008）均有应用。

一、附着生物成分的分析

附着生物种群和群落的取样点、取样时间及功能分析需要科学仔细地设计。采样点的设置和数量根据调研水体的形态和大小确定，采样点的选择要有代表性。采样的频率一般每年不少于4次，建议春、夏、秋、冬各1次。

1.附着生物的分离

附着基质不同，附着生物分离的方式也存在差异。附着基质主要有人工基质和天然基质。人工基质主要有玻璃片、聚乙烯片、花岗岩片、聚酯薄膜、人工植物等，天然基质主要有沉积物、石块、木块、水生植物、大型水生动物体表、枯木等。使用人工基质应仅限于附着生物的相对比较分析，例如沿污染的梯度。人工基质上的附着生物主要通过多次冲洗、物理剥离（毛刷洗刷、小刀刮）的方法进行，但此类方法也易低估附着生物群落的生物量或物种数，且可能对群落结构产生一定的干扰。目前，超声处理已发展为一种可取的方法。天然基质上附着生物的分离方法可借鉴人工基质的，但水生植物由于具有生物活性，其上附着生物的分离相对比较烦琐。一般采用物理方式（剧烈振荡法、软毛刷刷取法）并不能完全分离，辅以超声的效果比较好，尤其是对水生植物上附着细菌的洗脱非常有效。在解离附着生物的过程中，关键是要把附着生物有效地从叶片上洗脱下来，同时要避免对叶片组织结构的破坏，以免植物组织的内溶物、内生细菌对结果产生干扰。在无菌水中添加适当浓度的去污剂或者表面活性剂（如Tween80、焦磷酸钠等），加入pH缓冲液，再辅以超声、振荡处理，可以加快附着细菌从植物表面的解离，同时对附着细菌生物膜中的聚集体进行破碎均一化，有利于对细菌多样性的研究。

2.附着藻类色素的分析方法

附着藻类的色素主要包括叶绿素和胡萝卜素。附着藻类叶绿素的测定方法中，首先，选择溶剂很重要。溶剂的选择取决于取样群落，主要有丙酮、甲醇、乙醇。其次，提取辅助如研磨、振荡和超声波也很重要。目前比较常用的方法是90%丙酮提取法，分光光度法测定。

3.附着藻类和附着原生动物的种类鉴定

分离后的附着生物悬浊液用鲁哥试剂固定后，沉淀24h后弃去上清液，定容至30mL，以备附着藻类种类鉴定，加4%的福尔马林溶液可长期保存。用于鉴定原生动物的悬浊液可不加任何试剂，直接在显微镜下观察，也可直接加鲁哥试剂和4%的福尔马林溶液固定。样品鉴定一般鉴定到属或种。

二、附着生物空间结构分析

附着生物通常被定义为所有生活在浸没在水中的基质表面上的生物群落。为避免误解，附着生物群落的要素的空间排列应指其结构。各种显微技术使研究附着生物结构成为可能。光学显微镜只能观测到微界面附着物的表面结构，研究附着生物-附着基质的复杂关系是受限的，但它可以协助检测微界面附着物的全貌，在此基础上选择有代表性的样品片段进行深入观测。声学和光学速度计可用来描述附着生物群落附近和内部的水力条件、去向和来自附着生物的边界层运输。后来发展起来的扫描电镜技术大大促进了人们对微界面结构的了解。普通扫描电镜必须对植物样品进行逐级脱水、冷冻干燥和喷金等过程，容易造成植物表面附着物的脱落（Rogers，Breen，1981；Allanson，1973；刘凯辉等，2015）和自然结构的破坏，不能反映微界面附着物表面的真实情况。共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）可在精细尺度上研究完整的附着物结构（Larson，Passy，2005），但需要做切片，易对微界面附着物造成挤压变形，观测结果可能与微界面附着物的真实形貌存在较大误差，亦不能反映微界面的自然结构。近年来发展的基于共聚焦激光扫描显微术的光谱指纹技术可用于研究微界面附着物的深度剖面和生物监测。用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷金/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放入电镜内的冷台（温度可至-185℃）上即可进行观察，其中快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态，减少冰晶的产生，从而不影响样品的自然结构，冷冻传输系统保证在低温状态下对样品进行电镜观察。冷冻干燥辅助液氮脆断虽可以完整保存横截面形貌，但可能造成特定成分变形，而且测试成本较高。环境扫描电子显微镜（environmental scanning electron microscope，ESEM），可不对沉水植物进行任何前处理，在环境真空条件下直接分析微界面结构，可更直观地呈现微界面的真实结构，是研究沉水植物茎叶微界面结构的理想工具。核径迹纤维放射自显影法（nuclear track microautoradiographic，NTA）可研究特定养分元素的位置、量化和估计同化速率，用这种方法可估计单个附着生物种群同化的无机和有机碳。应用核径迹纤维放射自显影法和粒密度放射自显影技术（grain-density autoradiographic techniques）可提供附着生物群落内供给动力学和养分同化的信息。

三、附着生物群落结构分析

群落结构知识是解释其功能特征的基础，群落结构的量化应通过活体生物量的估计和计算来进行。在分子生物学技术使用之前，研究者们通过分离纯培养的方法（如涂平板法）观察细菌菌落的形态，并且通过不同的特征对细菌进行分类。该研究方法可以获得微生物菌株本身，并可进一步用于不同培养条件和微生物代谢等方面的研究。但该方法在很大程度上受到菌株分离方法、培养时间、培养基成分等的影响，而且环境中微生物的群落结构非常复杂，物种多样性极高，能够通过纯培养技术获得的微生物只占到环境中极少的一部分。现代分子生物学技术克服了传统纯培养技术的上述局限，可以在基因水平上进行细菌种类的鉴定。在原核生物中16 SrRNA基因普遍存在，它包括高度保守的序列区和高变区，是生物的种属鉴定和系统分类的重要分子基础，因此，对不同物种的16 SrRNA基因进行比较分析能够很好地研究生物的亲缘关系。研究环境微生物的主要分子技术有群落指纹图谱方法，包括变性凝胶电泳技术（denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE）、末端限制性片段长度多态性技术（terminal restriction fragment length polymorphisms，TRFLP），此外还有构建细菌克隆文库、荧光原位杂交（fluorescent in-situ hybridization，FISH）、基于16SrDNA的高通量测序法、基因芯片技术等。随着分子生物学的快速发展，现代分子生物学手段已经广泛用于微生物的多样性以及系统进化关系的研究。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）、荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）和克隆测序等是研究附着细菌群落结构的常规方法，但其分辨率和覆盖率不足，使用高通量测序技术现已成为一种新趋势，可对附着细菌的群落结构及多样性信息进行较全面的研究。二代测序方法以微生物目标基因的PCR产物为样本进行测序，一个反应得到几万至几百万条序列，测序的广度和深度大大提高。Illumina公司的MiSeq测序就是一种高通量的分析方法，能够全面获取细菌的群落结构及多样性信息，并且可以检测到一些稀有物种。这种测序技术能够对核酸片段进行深度测序，其技术原理是采用可逆性末端边合成边测序反应，在测序速度和通量上有了较大的提升。利用该技术可以对任何物种在DNA水平上进行全基因组测序、基因组靶向区域测序，检测基因组范围内的遗传变异或多态性。高通量测序技术已经广泛应用于研究微生物的群落结构及微生物的多样性。高通量列阵（The Access Array 48.48、AA48.48、Fluidigm Corporation、South San Francisco、CA、USA）通过使用阵列芯片，可同时进行2304个PCR的扩增，将样品定量PCR和序列文库PCR在一个反应中同时完成，该PCR产物可直接用于二代测序分析，仅需5h，与二代测序相结合，可同时得到微生物的群落组成和丰富度信息，简化二代测序样本的制备程序。二代测序的测序广度和深度较克隆文库的方法大大提高，尤其是提高了对数量上占少数的微生物群落的覆盖，不仅能从群落水平上揭示微生物群落组成的变化，而且能从更细的微生物分类水平上显示微生物群落的具体变化，在环境样品的16S rRNA、18S rRNA和功能基因的分析中均有应用。

四、附着生物功能分析

附着生物群落是一个功能微系统，它包括同时出现在界面层内的内部自养和异养过程。可将微量技术应用于用高分辨率（如氧、pH值的微电极；无机养分的化学分析，同位素示踪；酶分析）测定库和过程速率。为有效评价微生物和基质内代谢（水生植物组织和沉积物内）的相互关系，可建立几个实验和原位方法。如为使异质性最小和集中分析关键机制，可对群落进行分室研究；用简化的实验系统可有效地评价一些问题，如实验室附泥藻类分析中外来有机质负荷的调控将改变泥水界面的氧化还原条件和养分释放速率；大多数基质是活的，如植物组织或与无机和有机基质组分代谢耦合的陡分层的底栖微生物群落，因此必须充分理解耦合和基质代谢同步，以便定量测定出入附着生物的流通速率；可用综合参数来分析群落、物种代谢和养分、有机化合物循环。微电极、显微放射自显影（microautoradiography）、酶活性等可直接分析群落和物种水平的代谢和养分通量。

分析不同自然状态（贫营养、富营养、酸化等）和控制条件下重要元素（如碳、氮、磷、硫等）的代谢循环很重要。如P循环对藻类、细菌的分离速率、基质利用和有机、无机形态P的释放，尤其是光合作用、衰老和吸收的相互作用方面很重要。P较稳定，多数情况下很少释放到水中。现代技术如³²P和³³P标记有望解释这些途径和快速循环速率。对于N循环，对附着生物群落内和基质界面无机和有机N多种形态的定量方法还没有统一标准。证据表明，附着生物在调节无机N出入底泥和植物基质的速率、生态系统N固定、来自地下水的溶解性无机或有机N通量极其他过程中极其重要。现代方法（如酶活性、同位素示踪、代谢终产物分析等）可详细分析N循环中附着生物的功能。微量有机养分对附着生物群落的重要性目前还没有较好的测定方法。

附着微生物功能分析常用的方法有稳定同位素标记与微生物DNA或RNA分析相结合的方法、功能基因微列阵、微生物宏基因组和宏转录组分析及单细胞水平研究方法等。

FISH技术可确定细胞和组织中特异性转录物定位及其表达的相对水平，将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和元素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系，在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。这一技术是用标记生物素或地高辛的非同位素探针和所制备样本中的RNA进行杂交，将是研究复杂群落环境中原位基因表达较为有利的手段。另外，结合报告基因分析的FISH技术对于复杂微生物群落的结构与功能分析也是十分方便有利的。在微生物群落研究中利用FISH技术将原位杂交与功能研究结合是必然的发展趋势，可以进行基因表达和代谢水平的研究。

稳定性同位素示踪DNA/RNA-SIP是研究复杂环境中微生物功能的关键技术。其基本原理是利用稳定性重同位素底物（¹³C）原位培养复杂环境样品，超高速离心即可将¹³C-DNA/RNA与未标记的¹²C-DNA/RNA分离，获得具有活性的微生物群落DNA/RNA，从而开展下游分析。DNA/RNA-SIP实现了单一微生物向复杂微生物组研究的转变，为在整体水平系统研究微生物在自然环境中的重要生理过程、定向发掘重要微生物资源和生物技术开发提供了关键技术支撑。目前，DNA/RNA-SIP技术在微生物生态学、环境微生物学、地质微生物、海洋微生物、生物地球化学等领域得到了广泛应用，在元素生物地球化学循环、污染物生物降解过程、肠道微生物生理生态与健康医学、生物活性物质高通量筛选和合成生物学等方面的应用渐趋成熟，成为未来功能微生物组学研究的重要技术。

稳定性同位素联合宏基因组技术（SIP enabled metagenomics）可大大减少克隆的数量。通过稳定性同位素（SIP）实验使参与特定代谢过程（例如反硝化）的生物基因组得到富集，克隆从SIP实验中获得的¹³C标记的核酸，从而构建出在某一特定的环境过程中执行特定代谢功能（如可吸收或转化、代谢特定的标记基质）的环境微生物的功能宏基因组文库，就可重建一个较小、针对性强的目标微生物功能群基因组，从而极大地减少需要筛选的基因克隆数量，并且可直接利用分离出的¹³C-核酸构建宏基因组克隆文库。将DNA-SIP与宏基因组学结合技术可以帮助我们在种群水平解决目标微生物的功能问题，这一技术发展非常迅速，其中包括在宏基因组学上应用细胞分选和微流体技术，在单细胞染色体组方面应用激光拉曼光谱显微镜技术，在荧光原位杂交上应用等离子聚焦光谱测定技术以及放射自显影技术。稳定性同位素联合宏基因组技术可用于环境甲基营养菌（甲烷营养菌和甲醇营养菌）、有机污染物降解菌、根际微生物生态（植物、微生物、微动物相互作用）、厌氧环境中互营微生物等群落结构和特定代谢过程的功能分析，在微生物的种类鉴定和功能鉴定间建立了直接的联系。

微阵列（DNA microarray）也叫寡核苷酸阵列（oligonucleitide array），是一种研究有多少基因能相互作用以及一个细胞网如何同时控制大量基因的新方法。该技术的原理是在固体表面上集成已知序列的基因探针，被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测相应位置的杂交探针，实现基因信息的快速检测。微阵列技术已广泛应用于研究废水处理系统以及环境污染物中微生物参与的反应和调节过程及机制、营养物循环和富营养作用的微生物多样性、微生物生态学原理以及生物学过程中与环境胁迫反应相关的基因功能和调节控制研究，并建立了基因表达谱，特别是寡核苷酸微阵列是当前环境微生物群落功能研究中的一种有效手段。常用的微列阵有系统发育芯片（PhyloChip）（用于识别微生物以及微生物之间的系统发育联系，分析微生物的多样性）和功能基因芯片（GeoChip）（用于研究功能基因的多样性和功能微生物的活性）。

GeoChip是一种高通量基因芯片，可用于分析微生物群落，并研究其群落结构对生态系统的作用。该高通量基因芯片包括了编码参与主要地球化学循环（如碳循环、氮循环、金属抗性、有机物降解、硫循环和磷循环等）的微生物酶类的寡聚核苷酸探针。尽管基因芯片在基因表达研究中是一个强大的工具，但是，将其运用到环境微生物研究领域仍然存在着很多挑战，诸如探针设计、基因序列覆盖范围、特异性、敏感性和定量。为了解决这些问题，一种特殊的基因芯片即功能基因芯片应运而生并被广泛应用。功能基因芯片包含了涉及微生物所参与的各种过程的主要编码酶的基因序列的探针，它在将微生物多样性和微生物功能联系在一起的研究领域非常有用，因为基因芯片涵盖了功能已知的基因。在已知的基因芯片中，GeoChip是在生物地球化学、生态学和环境分析中最适用的，包括涉及碳循环、氮循环、磷循环、硫循环、各种金属抗性、抗生素抗性、有机污染物降解和能量传递等基因探针，并且有基于gyrB的系统发育分析标记。当前的GeoChip版本包括70000个功能基因，超过400种功能基因类别。阳性控制来自于核糖体基因，阴性控制来自于人类、植物和超嗜热菌基因。

微生物的基因组和转录组，即提取一种已知生物的DNA或RNA，不进行目标片段的PCR扩增，随机打断成几百个碱基的片段进行测序，得到全面的遗传信息，也称为鸟枪测序法。与基因组学和转录组学不同的是，宏基因组学和宏转录组学反映的是多种生物或环境中整个群落的特征，包含环境微生物的全部遗传信息，相比于16 SrRNA，除了群落中各种微生物群落的分类信息外，宏基因组学更是包含了所有微生物的基因信息，有助于对微生物群落的潜在功能进行深入分析。宏基因组学和宏转录组学呈现的是多种生物或环境中整个群落的特征，包含环境微生物的全部遗传信息。与稳定同位素标记相结合，较其他微生物多样性分析的方法，宏基因组学可以更全面地反映代谢特定底物的微生物的信息。