第一节　分子生物学概论

(一)分子生物学技术在肝胆胰外科中的应用

1.探讨发病机制

明确疾病的发生机制是准确诊断和合理治疗疾病的理论基础,分子生物学理论和技术的发展使人们能够从分子水平深入探讨疾病的发生机制。 譬如肝胆肿瘤的发病,大多伴有抑癌基因的突变和原癌基因的过度表达。 抑癌基因的失活和原癌基因的激活构成了肿瘤发生的分子生物学基础。

2.进行基因诊断

长期以来,疾病的诊断主要依据病史、症状、体征和各种辅助检查,如血液学、病理学、免疫学、微生物学、寄生虫学乃至物理学检查。然而,上述检查方法都有其各自的局限性,使得许多疾病未能被及时、准确地发现而延误了治疗良机。近年来分子生物学技术的迅速发展,已能从分子水平完成DNA、RNA 和蛋白质检测,在疾病的早期诊断方面起了关键作用。 基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、PCR 和DNA 芯片等,除对疾病作出正确诊断外,还能确定疾病的易感性、发病类型等相关状态,已在临床上广泛应用。

3.进行基因治疗

基因治疗是用正常或野生型基因校正或置换缺陷基因,以期纠正基因功能异常的一种治疗方法。 狭义的基因治疗是将目的基因导入靶细胞,无论与宿主基因发生整合与否,均能在细胞中得到表达,起到治疗疾病的作用。 而广义的基因治疗则在核酸水平上开展各项治疗方法,如通过反转录病毒导入抑癌基因或自杀性基因,以达到治疗肿瘤的目的。

4.药物设计

根据基因组学和结构生物学的研究结果,可针对具体疾病进行合理的药物设计。如明确了与某疾病发生有关的蛋白质及其异常功能,就可以设计和合成一些药物去激活、抑制或取代这些致病蛋白质,从而获得特异性的治疗效果。

5.器官移植

尽管器官移植已经取得了很大进展,但供体器官不足和免疫排斥仍然是当前该领域的一大障碍,利用来自人类基因组计划的信息资料,通过基因工程技术从遗传学角度改造动物,从而使被改造的动物携带不同组合的人类特异性抗原,有望解决上述难题。

(二)常用的医学分子生物学方法

1.DNA 克隆技术

是分子生物学的核心技术。将不同来源的DNA 分子在体外进行特异性切割、重新连接,组装成新的DNA 分子,再通过一定的方式导入宿主细胞内,进行复制和扩增,形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA 分子,称为DNA 克隆。其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝,以便进一步分析其结构与功能,最终改造细胞以及个体遗传性状。 其关键技术为DNA 重组技术。

2.核酸分子杂交技术

是分子生物学领域中最常用的基本技术之一。 两条来源不同的DNA 单链按碱基互补原则复性,形成一个杂种的DNA 双链,这个过程称为杂交,或称分子杂交,该过程具有高度的特异性。 核酸分子杂交技术包括Southern、Dot 和Northern 印迹技术。 原位杂交技术则是在核酸分子杂交和免疫组织化学技术的基础上发展起来的,利用核酸分子碱基互补配对的原理,用预先标记的DNA 和RNA 片段作为探针,通过探针与组织细胞中靶核酸分子的特异性结合,并借助于免疫组织化学技术,在组织细胞的原位显示某一特定基因及其转录产物mRNA,可对细胞内特定基因的表达进行定位和定量检测。

3.聚合酶链反应

简称PCR 技术,是在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖DNA 聚合酶的酶促反应,扩增DNA 和RNA 片段的方法。该技术能将目的基因片段在很短的时间内放大到百万倍,在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学等方面都得到广泛应用。 转录PCR、锚定PCR、反向PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RQ-PCR)、不对称PCR、多重PCR、单链构象多态性(PCR-SSCP)、原位PCR 等技术均是在此基础上发展起来的,其中RQ-PCR 具有灵敏、特异、技术成熟和操作简便等优点,对于临床上明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择合适治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值。

4.蛋白质分析

细胞的功能主要与生物蛋白相关,生物蛋白表达的种类与数量与细胞的生理功能息息相关。 由此产生蛋白分析技术,包括蛋白的提取、定量、分离、Western 印迹技术以及分子量测定等。

5.干细胞技术

干细胞是一种具有复制能力、可以分化形成各种组织的早期未分化细胞,可用来分化形成各种人体细胞甚至整个器官。 其基本方法包括干细胞的建立、培养、分化以及应用等。 干细胞技术在修补体内坏损细胞及器官移植方面有极为可观的发展前景。

6.基因芯片技术

基因芯片技术即是将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA 固定于选定的片基上,做成一高密度(核酸的密度可达65 000～600 000 个/cm2)的探针阵列,与样品中同源核酸杂交。 通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描后,对杂交结果进行计算机软件处理分析,获得杂交信号的强度以及分布模式图,以此反映目的材料中有关基因表达强弱的表达谱。 该技术通过检测探针的位置,便可知道确定靶基因的序列,并可对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析。

7.RNA 干扰技术

RNA 干扰技术是继PCR技术之后又一划时代的基因工程研究方法。 微小RNA(microRNAs,miRNAs)是近年来揭示出的一类长度约为21～25 个核苷酸的非编码小分子RNA(non-coding small RNA),它们通过与靶基因mRNA的3’非编码区(untranslated region,UTR)互补结合,在转录后水平上调控靶基因的表达或抑制靶蛋白的翻译。 大量证据表明,miRNAs 可以通过靶向调控E2F、Cdks、cyclins、CKI 等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子,进而调控细胞周期,并且这种由miRNAs 介导的细胞周期调控方式与恶性肿瘤的发生发展密切相关。 miRNAs 通过调控其靶基因参与的信号通路,影响肿瘤的发生发展,发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。

目前研究miRNA 表达的方法主要包括Northern blotting、实时定量PCR、RNA 酶保护分析(ribonuclease protection assay, RPA)、 磁 珠 流 式 检 测(bead-based flow cytometric assay)、原位杂交(in situ hybridization)、高通量的miRNA 表达谱芯片(miRNA microarray)、深度测序miRNA(miRNA deep sequencing)等。 RNA 干扰技术主要采用过表达或干涉(抑制、敲除)等方法,提高或抑制特定miRNA 在细胞内的表达水平,检测其表达异常所引起的细胞表型变化,研究其功能。 阐明miRNAs 在细胞周期调控网络中所扮演的功能角色,尤其是其在人类肿瘤发生发展过程中的作用机制是值得深入研究的。

总的来说,医学分子生物学技术一直随着分子生物学技术的发展而发展。