在层流手术间，患者双侧髂后上棘常规消毒、铺无菌单、局麻，严格按照 《骨髓穿刺术》规范化操作，骨髓血抽取量为50～100ml，所获细胞总数不低于2×10 ⁷个。骨髓血的收取、标记、记录及转送按标准操作程序(standard operating procedures，SOP)由专人负责，严格核对。在洁净实验室(GLP/GMP实验室)，将骨髓血分离、培养和扩增，制备过程中必须严格无菌操作，操作步骤必须规范化、标准化。分离BMSC的常用方法有密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和全骨髓贴壁培养法三种。

通过介质和离心力场的作用使细胞分层并分离，可排除红细胞对间充质干细胞贴壁的影响，获得的细胞纯度较高，缺点是对间充质干细胞生长的骨髓微环境破坏较大，此外细胞流失较多。

通过BMSC表面带有或缺失的抗原成分，进行正选或负选而获得纯度较高的细胞，但可能在一定程度上影响细胞活性，费用也较高。

利用BMSC贴壁生长的特性，通过换液逐步去除漂浮生长的血细胞和造血干细胞以得到较纯的BMSC，并保留了骨髓中的促黏附物质和有利于BMSC生长的细胞因子，细胞增殖快、数量多，传代后纯化程度与前两种方法相似。

综合考虑各方面因素，推荐首选全骨髓贴壁法，采用无血清培养液，5%CO ₂、37℃孵育，每3～4天更换培养液，培养期间需要检查细胞形态、培养液颜色变化、细菌污染、细胞死亡等情况，并分阶段(分离前、分离中、培养中)做微生物评估。用胰酶替代物(TrypLE)消化，以生理盐水稀释至所需容量，计数细胞总数，用于治疗的BMSC浓度应不低于1×10 ⁹。测定活力，用流式细胞仪鉴定骨髓干细胞的成分，BMSC应CD105、CD90和CD73表达阳性，CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79或CD19和HLA-DR表达阴性。制备的干细胞在4℃冰箱保存的时间不应超过6小时。为提高骨髓干细胞的含量，也可在采集骨髓前使用 G-CSF短期动员骨髓 ^[15，16]。通常采用小剂量(2～4μg/kg体重)的G-CSF动员2～3天，之后按照上述方法进行骨髓抽取、干细胞分离和移植。小剂量短期动员可促进骨髓干细胞的增殖，但并不促进骨髓干细胞向外周血的大量释放。经此种方法获取的骨髓血含有更多的骨髓干细胞(数量可达10 ¹⁰～10 ¹²)，有助于提高治疗效果。

在层流手术间，患者腹部用3%氯己定消毒、铺无菌单、局麻，严格按照 《腹部抽脂术》规范化操作，抽取约100ml的脂肪。脂肪的收取、标记、记录及转送按标准操作程序(standard operating procedures，SOP)由专人负责，严格核对。在洁净实验室(GLP/GMP实验室)，将脂肪组织用PBS清洗2遍，以清除小血管及结缔组织，然后剪成碎片，在3mg/ml NB6-胶原酶37℃下消化30分钟。PBS-EDTA(1mm EDTA/1ml PBS)终止消化后，室温下500g离心10分钟，去除脂滴层和液体层，保留基质血管碎片层(stromal vascular fraction，SVF)。再次用PBS-EDTA溶液悬浮SVF，用70μm细胞滤器过滤，20℃ 300g离心5分钟，计数后，采用无血清培养液，5%CO ₂、37℃孵育，每3～4天更换培养液，培养期间需要检查细胞形态、培养液颜色变化、细菌污染、细胞死亡等情况，并分阶段(分离前、分离中、培养中)做微生物评估。用胰酶替代物(TrypLE)消化，以生理盐水稀释至所需容量，计数细胞总数，用于治疗的ADSC浓度应不低于1×10 ⁹。进行染色质核型分析。用流式细胞仪鉴定 ADSC的成分，ADSC应 CD14、CD73和 CD105表达阳性，CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性。制备的干细胞在4℃冰箱保存的时间不应超过6小时。