1.3　生物修复技术

生物修复技术最早应用于清除美国宾夕法尼亚州Ambler管线泄漏的汽油（1972年）。该技术的应用规模最初很小，仅处于试验阶段，直至1989年美国阿拉斯加海域受到大面积石油污染以后，生物修复技术才得到大规模应用。美国从1991年开始实施庞大的土壤、地下水、海滩等环境危险污染物的治理项目。欧洲各发达国家从20世纪80年代中期开始研究生物修复技术，并将其应用于一些实际工程中。德国、荷兰等国在生物修复技术应用方面处于欧洲前列。

我国的生物修复技术处于刚刚起步阶段。在过去的十几年中主要是跟随其他国家生物修复技术的发展，最初的生物修复应用是利用细菌来治理石油、农药之类的有机污染，但大面积应用的例子较少。随着研究的不断深入，生物修复技术又应用于对地下水、土壤等污染的治理上，而且修复技术已由细菌修复拓展到真菌、植物、动物修复，由有机污染物的生物修复拓展到无机污染物的生物修复。

1.3.1　植物修复技术及研究现状

植物修复是以植物能够忍耐和超量积累重金属、有机物或放射性元素的理论为基础，通过植物及其共生微生物体系来清除环境中污染物的一种污染治理技术。1977年，Brooks等首先提出了超富集植物的概念。1983年，美国科学家Chaney首次提出运用植物来去除土壤或沉积物中重金属等污染物的设想，自此，人们逐渐将植物修复技术作为重金属污染治理研究的重点。

目前，英国、美国、德国、意大利、澳大利亚等国家已就植物修复方式进行了大量的研究。美国等一些发达国家大规模的试验表明，植物修复技术是一项切实有效的、有希望的、能廉价处理某些有毒污染物的新方法。据美国D.Glass公司估计，2005年美国植物修复技术市场投入可高达3.7亿美元。在欧洲和北美地区，采用植物修复技术治理重金属污染土壤的年均市场价值高达40亿美元。国外有些国家已进行了野外大规模试验，并达到了商业化水平。例如Edenspace公司成功研发出针对铅、锌、锡和砷污染的植物修复技术。英国利物浦大学的Bradsha最早利用矿山废弃地的耐性植物对矿山土地进行了修复，并且成功地开发出可商业化应用的针对不同重金属矿山废弃地的耐性植物。

重金属的植物修复包括植物提取、植物挥发、植物过滤或根系过滤、植物钝化等。植物提取是利用植物对重金属的吸收和在地上部的积累，收获地上部植物以减少土壤中的重金属含量，可以较彻底地去除土壤或沉积物中的重金属，是公认的去除环境中重金属污染物最主要的方法。植物挥发是利用植物促进重金属转变为可挥发形态，脱离土壤和植物的表面。植物过滤是利用植物根系的吸收能力和表面积或利用整个植株来去除废水或土壤中的重金属。植物钝化是利用植物促进重金属转变为低毒性形态，从而减轻重金属毒害的一种方法。在这一过程中，土壤的重金属含量并不减少，只是形态发生变化。

有机化合物能否被植物吸收，并在植物体内发生转移，完全取决于有机化合物的可溶性、亲水性、极性及其分子量大小。有机质亲水性越强，就越难被植物吸收。植物去除环境中有机物的机理有三种，包括植物直接吸收、植物和根际微生物的联合作用以及植物根系释放分泌物和酶。

植物吸收是指植物对有机物的吸收，这主要与有机物的相对亲脂性有关。化合物被植物吸收后，以一种被植物利用的形式束缚于植物组织中，如胡萝卜对二氯二苯基-三氯乙烷的吸收。环境中大多数苯系物、有机氯化剂和短链脂肪族化合物都可以通过植物吸收方式去除。植物和根际微生物的联合作用是指植物通过向根际分泌氨基酸等低分子营养物质来刺激根际附近微生物的大量繁殖，间接促进根际微生物有机污染物的降解。植物能以多种方式刺激微生物对有机污染物进行转化，根系分泌物可以刺激土壤微生物的活动，增加其数量，而微生物可以加速许多种有机农药、甲基硫类物质及某些杀虫剂的降解。

根据植物对重金属的吸收、转移和累积，可用于植物修复的植物主要有超富集型、指示型（敏感型）和排斥型。其中，超富集植物是植物修复中普遍运用、且修复效果较好的植物。超富集植物可以耐受很高的重金属离子且可将沉积物或土壤中的重金属离子大量吸入体内，但却可以保持生长。在植物提取中，超富集植物的筛选是当前研究的重点。世界上已发现的超富集植物有500多种，且主要集中在十字花科，如国际上研究最广泛的芸苔属、遏蓝菜属及庭介属，大多发现于欧美、新西兰及澳大利亚等国的污染地区。我国发现的超富集植物有400多种，包括对铅的超富集植物羽叶鬼针草、酸模和茴麻，镉的超富集植物龙葵，锌的超富集植物东南景天、天蓝遏蓝菜，锰和镉的超富集植物商陆，铜的超富集植物香薷属植物等。而且，这些植物中有70%以上为镍的超富集植物。

指示植物对重金属的吸收量随着重金属生物有效性的增加而增加。一般要求每种指示植物吸收某一特定的重金属离子，或多种互不干扰的重金属，从而可通过分析植物体内的重金属浓度来评价土壤或沉积物的污染状况及生物可利用性，很直观地反映出污染土壤或沉积物的修复效果。

排斥型植物若本身具有避性，则对土壤或沉积物中的重金属具有一定的排斥性，即土壤中的重金属不会被该植物吸入体内，也不会对植物生长产生毒害作用。因此，在土壤重金属生物有效性得到一定降低后，种植具有一定排斥能力的避性植物，可在“不安全”土壤或沉积物上长出“安全”产品。

到目前为止，植物修复仍处于试验阶段，对污染环境治理具有很大局限性。目前发现的可植物修复的超积累植物一般地上部分生物量小、生长缓慢且受季节性限制较强，修复效率不高。且不同植物仅对某种污染有较好修复效果，对复合污染土壤的修复收效甚微，还应防止植物的果实被误食而污染食物链。因此，需不断完善植物修复，采取各种辅助措施来提高植物修复效率。

1.3.2　植物修复辅助措施及研究现状

20世纪90年代以后，许多学者注意到了植物和微生物共存体系对重金属超积累的重要性，通过对土壤环境因子进行调控，以提高植物对重金属的可吸收性。也有许多学者在寻找超积累植物的同时，又转向了对超积累植物耐性机理的研究，运用基因工程和现代分子生物技术，将超量积累植物和生物量高的亲缘植物杂交，改变了超富集植物生物量小、生长慢的缺点，并对土壤修复的工艺进行了研究，结合土壤改良剂等各方面因素，提高植物对重金属积累的有效性，加快对重金属污染土壤的植物修复进程。归纳起来，重金属污染土壤的植物修复强化途径主要有两种，一是提高植物生物量，二是提高植物体内重金属含量。根据上述目的，可将提高植物对土壤或沉积物重金属的措施有以下几种。

1.3.2.1　与化学方法相结合

主要包括调节土壤pH值、施加螯合剂及螯合肽、施加植物营养等。

pH值是影响土壤中重金属生物有效性的重要因子。研究表明，适当降低pH值可大大提高土壤溶液中重金属阳离子的浓度，增加其生物有效性。通过使用土壤酸化剂或含铵肥料，可增加植物对重金属的吸收。对于重金属阴离子（如砷），则需要投加生石灰等碱性物质来增加土壤pH值，增大土壤溶液中的阴离子含量，使植物对阴离子的吸收量增加。

污染土壤中大部分重金属以固相形态吸附于土壤胶体和颗粒表面。螯合剂则对沉积物中的重金属具有活化作用，它主要是通过与沉积物溶液中的重金属离子结合，降低沉积物液相中的重金属离子浓度，打破沉淀-溶解平衡，促进固相金属离子的溶解，形成新的溶解-沉淀平衡，从而提高了重金属根际扩散能力，提高植物修复的效果。不同螯合剂和不同重金属之间存在选择性，它们之间存在最佳组合。如乙二胺四乙醇（EDTA）对铅，EGTA对镉，EDDS对铜，柠檬酸对铀分别具有很高的选择性。螯合剂的投加模式也会影响植物修复的效果。例如，Luo等研究发现，当EDTA以热熔液形式施入种植植物的土壤后，植物地上部分对铅的累积量是常温溶液下最大累计量的7倍。

然而，螯合剂的使用通常会对植物产生毒害作用，使植物黄化、萎蔫，甚至死亡，且不同螯合剂对植物的毒害作用不同。例如，投加EDTA后，植物地上部生物量均有不同程度的降低。螯合剂的毒害作用与螯合剂的投加时间、投加模式以及供试植物的耐受性等有关。一次投加比多次投加效果要好，但会增加对植物的毒害以及重金属向地下渗滤的风险。多次投加效果虽然不如一次投加好，但会降低对植物的毒害作用，增强植物的耐受性。因此，应综合考虑目标重金属、螯合剂、植物、土壤等多方面因素。

植物螯合肽是在重金属诱导下合成的由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的含巯基多肽。它具有很强重金属结合能力，可与多种重金属结合形成螯合物，对重金属具有富集和解毒作用，并且对必需金属元素在真核生物（微藻、真菌和高等植物）细胞内的分布具有调节作用。

向污染土壤或沉积物中施加植物营养液或生长调节剂，可促进植物地上部的生长，提高生长量，并能促进植物根系的发育。植物的根系在植物对重金属的超积累或固定中起着重要作用。因此，发达的植物根系有利于植物对重金属的吸收。例如，在镉污染土壤中施入腐殖酸能使烟草茎中镉的含量大大增加。

然而，植物修复不仅要考察植物对重金属等污染物的提取效率及修复潜力，更需检测修复前后土壤的质量状况及添加剂带来的潜在生态环境风险。研究表明，施加螯合剂等化学试剂确实可能会带来一些潜在风险，如重金属的渗滤及二次污染问题，这大大限制了植物修复与化学方法相结合使用的实际效用。

1.3.2.2　与生物方法相结合

植物与生物方法相结合是将植物与微生物结合起来形成共生体，可以减少植物根对重金属的吸收。由于根际微生物能够改变金属离子在环境中的存在形态，在种植植物的土壤中施用接种菌种也能够促进植物吸收和积累重金属，而且作用显著。利用植物菌根技术对重金属和有机物污染土壤进行直接或间接修复，可有效降低污染物毒性。1991年首次报道了石楠菌根能够降低植物对过量重金属铜和锌的吸收。之后，人们对菌根的重金属修复作用产生了浓厚的兴趣。丛枝菌根AM真菌是自然界中分布最广的一类菌根，也是土壤微生物区系中最重要的成员之一，对自然生态系统中植物的营养循环和逆境耐受能力起着重要作用。从生态学角度来看，AM真菌与植物根系的紧密联系是自然界中最古老、最重要的微生物与植物的生态共生关系。AM真菌能与世界上80%以上的植物形成丛植菌根，且与绝大多数的草本植物共生。Ortega Larrocea等在墨西哥伊达尔戈州的矿山废弃物中发现，Glomus属和Acaulospora属是主要的菌根真菌物种。

研究证明，AM真菌不仅自身有耐金属毒害的能力，而且能抑制重金属从根系向地上部分移动，还可以提高植物对重金属的耐性，从而有利于植物生长。例如，在锌胁迫下接种了AM真菌后，AM有效地阻挡了金属锌进入根部，植物组织内锌含量显著下降，而生物量显著上升。在铅胁迫下，AM真菌可以增加鸡眼草、黑麦草、白三叶草等的生物量。菌根还能通过降低土壤pH值和分泌物成分来促进菌根植物对重金属的纯化。何章莉指出，根际土壤的pH值比非根际土壤低1～2个单位，就能显著活化重金属，而Jones发现有机酸能与重金属结合，可降低重金属毒性。

也有报道显示，AM真菌能够提高宿主植物对重金属的积累和分配，增加植物体内重金属积累量，提高植物提取的效果。例如，Usman在种植玉米和向日葵的重金属污染土壤上接种AM真菌后，植物生物量显著增加，且植物体内的锌、铜和镉含量也显著增加。黄艺等测定了不同施锌、铜水平下苗木体内的铜、锌含量，发现菌根苗木体内铜和锌含量分别是非菌根植物体内含量的2.6倍和1.3倍。此外，丛植菌根具有抵消矿区复垦区覆土少而导致植株产量降低的可能性，可大大节约复垦费用。这些都为AM真菌的田间应用提供了理论和实践依据。然而，土壤、水分、气候、病害、施肥等因素都有可能影响到植物的生长和丛枝菌根的发育，从而影响植物修复的田间应用。

可见，采用植物对重金属的忍耐和超量积累能力并结合共生的微生物体系来实现对重金属污染环境的修复，能在不破坏土壤生态环境，保持土壤结构和微生物活性的情况下，通过植物的根系直接将大量的重金属元素吸收，收获植物地上部分或促进植物钝化来修复被污染的土壤。

1.3.2.3　与基因工程相结合

将植物修复与基因工程相结合，主要应用在超积累植物修复中。在修复土壤重金属污染中，超富集植物表现出了很大的发展潜力。然而，到目前为止，发现的大多数超积累植物具有生长缓慢、个体矮小、修复效率低等缺点。此外，已发现的超富集植物多数生长在矿山区、成矿带或由富含某些化学元素的岩石风化而成的地表土壤中，具有特有生态型，生态适应性较窄。而应用转基因技术将积累植物的超富集性状转移到生长速度快、生物量大且适应性强的植物体内，可大大提高植物修复效率。目前，已分离出与金属化合物形态转化有关的基因，如金属硫蛋白基因（MT）、汞离子还原酶基因（merA）、植物螯合肽基因（PCs）等。基因的分离和克隆技术相结合有助于运用基因工程手段得到对不同重金属有抗性的转基因植物。例如，美国利用基因工程技术把汞离子还原酶基因merA和merB移植到植物体内，研制出了去除汞的转基因植物拟南芥菜和烟草，有效地将甲基汞及有机汞转化为无机汞。

1.3.2.4　与农田、园艺技术相结合

通过育种技术对野生超富集植物进行培育以及性能改进，提高植物地上部分生物量，可更有效用于植物修复中。例如，利用种子包衣技术给超富集植物很小的种子上包上一层物质，可防止苗期病虫害；使用蚯蚓可活化土壤中养分，促进养分吸收及生物量累积，强化污染土壤的植物修复技术。

在污染土壤上种植观赏性植物具有绿化和美化环境的效果。研究表明，观赏性植物具有生物量大和对重金属有耐性等特征，可应用于重金属污染土壤的植物修复中。比如用草、美人蕉可修复镉污染的土壤，紫茉莉、凤仙、金盏菊和蜀葵对镉、铅单一污染及二者复合污染具有很强的耐性和积累性。

本书首次尝试采用植物与化学方法相结合、植物与生物方法相结合的方式对南排污河排污口附近沉积物进行处理，研究螯合剂、菌根真菌对复合污染土壤的辅助修复效果，寻求针对入海排污河道疏浚底泥的最佳异位生物修复方式。

1.3.3　厌氧微生物修复技术及研究现状

植物修复技术主要应用于修复土壤中的无机污染物，受有机污染物污染的土壤则优先考虑以微生物的修复研究为主，这主要是因为微生物是唯一可以将有机污染物作为生长碳源的生物，并可通过代谢作用将有毒有害有机物完全矿化为无害化学物质如二氧化碳和水，且费用较物理化学修复低很多。

芳香族化合物，如单环芳烃BTEX（苯、甲苯、乙苯、二甲苯）和多环芳烃，是主要的含水层有机污染物。在地表水环境中，由于BTEX的浓度和可移动性相对较高，被认为是最普遍、对供水安全存在隐患的污染物，会造成显著环境威胁。在有机物污染的地表水系统中，氧消耗非常快，含水层通常处于缺氧或厌氧状态，沿水流方向形成还原梯度。BTEX很少会通过自然物理或化学方式降解，但许多研究结果表明，BTEX会在硫酸盐、硝酸盐或铁还原的条件下，在厌氧微生物的作用下自然降解。这说明地表水中的主要污染物（如BTEX）能在缺氧区被降解，厌氧微生物降解是污染物自然衰减的关键过程。此外，由于芳香族化合物在生物地质化学碳循环（包括10%～20%的生物量）中起了重要作用，而其化学过程必须克服共轭循环的高共振能量，因此，其代谢过程引起了科研界的广泛关注。

国内外已有许多关于不同沉积物样品或纯菌液的BTEX厌氧生物降解的研究，研究结果表明，这些化合物可通过利用电子受体得到降解。第一个厌氧芳烃降解模型“甲苯”的降解速度相对较快，使得微生物在不同的电子还原条件下迅速生长。含水层柱状样中首次发现微生物可利用硝酸盐作为电子受体来降解甲苯。随后，在使用多种电子受体的情况下，甲苯厌氧降解被反复运用于焦油污染含水层、富集微生物菌群和纯菌液的研究中。此外，甲苯厌氧降解还可发生在产甲烷菌富集菌液和发酵互养菌液中。

在过去的20多年中，许多科学家对污染含水层中的土壤或沉积物进行了富集，并研究了菌液中的生物群落，结果发现Beta-变形杆菌和Delta-变形杆菌主要参与了外源基质的降解。研究主要集中在分离和确定在较普遍环境污染物［BTEX和多环芳烃（PAHs）］净化过程中起重要作用的厌氧菌的特征，并分离出了许多革兰阴性甲苯降解菌，如还原硝酸盐氧化甲苯的Beta-变形杆菌Thauera aromatic strain T1和K172等；还原铁离子氧化甲苯的Delta-变形杆菌Geobacter metallireducens GS-15等；还原硫酸盐氧化甲苯的细菌Desulfobacula toluolica Tol2等。最近，有报道称在梭状芽孢杆菌中发现了甲苯降解菌，然而，至今仍未分离出降解甲苯的厚壁菌的纯菌液。

在研究厌氧微生物菌群结构中，16S rRNA基因的应用最广泛。16S rRNA是细菌染色体上编码核糖体核苷酸（rRNA）对应的DNA序列。它具有高度的保守性、特异性和足够长的基因序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。作为一种分子计时器，16S rRNA基因已被普遍应用于检测微生物之间的进化论关系，并可通过其序列构建出细菌菌群结构的基础框架。

芳香烃的厌氧降解由各种生物化学反应组成。近年来，已确定了一些烃类物质降解初始激活反应的标志性代谢物、功能基因和酶。苯环的初始激活反应对于芳香族化合物的厌氧降解来说至关重要。初始激活反应需要非常高的激活能量，为了克服这种能量，不同的微生物会使用特殊的酶来催化一些烃类物质的反应。在不同的代谢步骤中，每一步用来催化的酶在不同生物体内不一定相同。功能基因是用来编码这种特殊的酶即蛋白质的，同一个蛋白质可以由许多不同的功能基因来编码。因此，研究功能基因的多样性可作为16S rRNA基因的互补信息，能更准确地分析微生物体内烃类物质的代谢即修复过程，可大大增加对微生物菌群结构的了解。

目前，对微生物菌群结构的研究方法主要为构建克隆文库，指纹识别技术［变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）］，定量技术［荧光原位杂交（FISH）、定量槽杂交］，基因组学（454测序、illumina）等。构建克隆文库虽需要分析足够数量的单克隆，耗时、耗力又耗财，但可得到比较完整的种群组成情况，能全面了解微生物菌群多样性。DGGE所分析的DNA片段较短，不能具体准确地确定微生物的分类，但运用该方法可快速得出微生物群落组成结构随时间和空间的变化。基因组学是新型生物学研究技术，无需构建克隆文库，即获得较大的数据量和较准确的结果，为环境微生物生态多样性研究带来了革新，但在数据的处理上，需要大量软件及计算机系统的支持。

对功能基因多样性的研究方法目前主要集中在传统的构建克隆文库上。有些研究中也应用了变性梯度凝胶电泳（DGGE），如Sakurkai利用PCR-DGGE方法对土壤中碱性金属蛋白酶基因和中性金属蛋白酶基因多样性进行了研究。Geets利用DGGE研究异化亚硫酸盐还原酶DsrB基因的多样性。

本书将以入海河道沉积物中检出的单环芳烃类物质为研究对象，联合使用16S rRNA基因和苯环开环基因bamA来研究单环芳烃类物质厌氧降解过程中的微生物菌群结构变化和功能基因多样性。在bamA基因多样性的研究方面，除了使用传统的克隆方法外，首次尝试使用DGGE方法进行研究，进一步确定bamA基因作为苯环开环标记物的潜力，完善芳烃物质的厌氧代谢机理。