第四节 核酸琼脂糖凝胶电泳
核酸琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质对核酸进行电泳的方法，其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是，琼脂糖凝胶兼有分子筛和电泳的双重作用。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2～20 kb，利用脉冲电泳，可分离10 Mbp以上的DNA片段。
一、琼脂糖的种类
琼脂糖凝胶电泳的主要作用有：第一，根据已知分子大小的标准DNA对样品DNA的大小进行测定；第二，用标准DNA对样品DNA量进行估算；第三，回收纯化目的DNA片段。
早期的电泳载体为天然琼脂（agar），它是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象而影响电泳速度及分离效果。所以目前的电泳都是使用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖是从琼脂中提取出来的链状多糖，含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。
用于核酸电泳的琼脂糖不能检测到明显的DNase和RNase活性，如果是用于检测型电泳要考虑电内渗和凝胶的强度，而用于制备性电泳要考虑琼脂糖的纯度和类型。目前商品化琼脂糖的种类繁多，不同公司的产品或者不同型号的产品，其杂质含量不同，制备凝胶的强度、分辨DNA的能力和荧光背景的强度都不同，因此要根据实验用途加以选择使用。需要注意的是，即使是相同的商品名称，不同厂家生产的琼脂糖其纯度也是不一样的，对电泳也会产生不同的影响。不同类型琼脂糖对DNA电泳的影响可以参照表2-5。
表2-5 不同类型琼脂糖分离线性DNA片段大小的范围
琼脂糖的分类按其熔点可分为：标准熔点琼脂糖和低熔点琼脂糖，按其纯度可分为标准琼脂糖和高纯度琼脂糖。商品化的琼脂糖主要分成以下类型：
标准琼脂糖，熔点约为90℃，1%凝胶强度≥1200g/cm2，硫酸盐≤0.15%，电内渗EEO（-mr）≤0.15，不能检测到明显的DNase和RNase活性。
低熔点琼脂糖（LMP），熔点为≤65℃，1%凝胶强度≥200 g/cm2，硫酸盐≤0.10%，电内渗EEO（-mr）≤0.1，不能检测到明显的DNase和RNase活性。低熔点的琼脂糖可以在65℃时熔化，熔化后，在37℃可保持液态数小时，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中回收，这样可以在电泳后从琼脂糖凝胶中回收特定的DNA条带用于以后的克隆操作。虽然现在的琼脂糖回收试剂盒可以用于标准琼脂糖的DNA回收，但低熔点琼脂糖一般纯度更高，熔点更低，而65℃低于大多数核酸Tm，因此用于DNA片段，特别是较大的DNA片段回收的效率更高。
有些纯度较高的低熔点琼脂糖，可直接在重熔的琼脂糖中进行DNA克隆操作，无须DNA的抽提纯化步骤，如直接在重熔的琼脂糖进行酶切、连接和转化，也可以直接进行PCR反应等。有些高分辨的低熔点琼脂糖，能有效地分辨10～1000 bp的DNA片段，适合用于小DNA片段的分离和回收。
有些低黏度、低熔点琼脂糖，它是经化学修饰后，纯度更高，熔点更低的琼脂糖，熔点≤50℃，1%凝胶强度≥75 g/cm2，电内渗EEO（-mr）≤0.05，能够分辨更小的DNA片段（小于10 bp），可直接在重熔的琼脂糖中进行克隆操作，无须DNA的抽提步骤，也可以用于细胞的封装和包埋后电泳。
高强度琼脂糖比标准熔点琼脂糖具有更高的熔点，一般熔点在95℃以上，其凝胶强度更高，1%凝胶强度≥1300 g/cm2，相同浓度下比标准熔点琼脂糖对DNA的阻尼性更强，分辨率更高，适用于鉴定小于1 kb的DNA片段。
随着技术的发展和更专业的实验要求，目前针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶。总的来说，低熔点凝胶对DNA的回收效率更高、更方便；高纯度凝胶适合直接在重熔的凝胶中进行DNA后续的酶促反应；高分辨率凝胶可以让DNA条带更加清晰；高强度凝胶可以方便操作；低电渗的凝胶能使DNA条带电泳更快，缩短电泳时间。
二、电泳缓冲液组分
电泳缓冲液是指在进行核酸电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。缓冲液的组成和离子强度直接影响DNA迁移率。虽然Tris-Cl是最常用的缓冲液体系，但由于其中的Cl-泳动速率比样品分子快很多，容易引起电泳带型的不均一现象，所以电泳缓冲液常采用含有EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）或者Tris-磷酸（TPE）缓冲液体系来进行双链DNA电泳。缓冲液的EDTA可以螯合Mg2+等二价离子，以防止其在电泳时激活DNase降解DNA，此外还可防止Mg2+与核酸生成沉淀，Na+使缓冲液有一定的导电性。
TBE的缓冲能力强，适合用于长时间电泳（如过夜），并且当用于小于1 kb的片段时分离效果更好，但TBE容易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不适用于对DNA回收率要求较高的电泳。此外，由于硼离子对T4 DNA连接酶有抑制作用，如果硼离子去除不彻底会影响到连接效率，所以若制备的DNA片段需用于连接反应，最好使用TAE缓冲液。
TPE的缓冲能力强，适于长时间电泳，但TPE含磷酸盐浓度高，容易使DNA发生沉淀，也不适用于DNA的回收。
TAE是使用最广泛的缓冲液，其特点是超螺旋DNA在TAE中分辨率比在TBE中好，测得的分子大小更接近于实际，用TBE电泳时，分子大小的测量值会大于实际值。双链线状DNA在TAE缓冲液中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，大于13 kb的DNA片段用TAE缓冲液电泳将取得更好的分离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，不适合长时间电泳（如过夜），如需长时间电泳必须要有循环装置，使两极的缓冲液得到交换。
电泳缓冲液通常配成浓缩液于室温保存，TAE为50×，TPE为10×，TBE为5×，但TBE浓缩液长时间保存会发生沉淀，不适宜长期保存。缓冲液的工作浓度TAE为1×，TPE为1×，TBE为0.5×。
由于RNA易降解，所以RNA的电泳比DNA的电泳操作复杂。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，乙醇干燥，然后灌满3%H2O2，于室温放置10 min，再用经DEPC处理的水彻底冲洗。
RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%～1.4%的凝胶，不同的RNA条带即能分开，但无法判断其分子大小。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子大小的对数呈线性关系，因此要测定RNA的分子大小，一定要用变性凝胶，而在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
RNA变性凝胶电泳缓冲液采用MOPS缓冲液，10×的MOPS缓冲液组成：0.4 mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS）（pH7.0），0.1 mol/L NaAc，10 mol/L EDTA，用甲醛或乙二醛加上二甲基亚砜（DMSO）作为变性剂。乙二醛-DMSO凝胶比含有甲醛-DMSO凝胶更难于进行电泳，因为RNA在乙二醛-DMSO凝胶中泳动速率较慢，而且需将电泳液进行循环以避免电泳过程中形成过高的H+梯度，尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率，但用含有乙二醛-DMSO的凝胶对RNA进行电泳分离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。需要注意的是，乙二醛可与EB发生化学反应，所以制胶和电泳过程中避免使用EB，应选择电泳后染色。
三、凝胶的染色方法
琼脂糖凝胶的染色方法（以EB为例）有两种，一种是电泳后染色，一种是染色与电泳同时进行。
电泳完毕将凝胶放到含0.5μg/mL EB的电泳缓冲液或水中，于室温下染色20～40 min，即可置于紫外灯下观察。若再用水浸泡20 min可以减少背景，提高检测的灵敏度。当EB太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30 min后再观察。EB浓度过高会增加背景，过低会使DNA染色不足，都会降低EB检测的灵敏度。
在琼脂糖熔化后加入EB至终浓度0.5μg/mL，制好胶，然后加样电泳，电泳结束就可以直接在紫外灯下观察；也可以在电泳槽的电泳缓冲液里加入EB至终浓度0.5μg/mL，然后放入琼脂糖凝胶上样电泳，电泳结束后也可在紫外灯下直接观察。染色与电泳同时进行可以在电泳过程中随时观察核酸迁移情况，EB带正电荷，在电场中向正极移动，电泳时间长后正极EB的浓度升高，背景会加深，而负极EB浓度降低，背景降低。
EB的正电荷可中和核酸分子的负电荷，同时由于它的嵌入增加了核酸分子的刚性，所以在含EB的胶内电泳，核酸的迁移速度减慢，如双链线状DNA迁移速度减慢约15%。因此，用电泳方法测定核酸分子大小时，应在电泳后染色更为准确。另外，在凝胶中未与核酸结合的EB向负极泳动，会使样品中各条带染色不均匀，故此法也不宜用于根据荧光强度定量检测核酸。
四、琼脂糖的脉冲电泳
脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）是一种分离大分子DNA的电泳方法。在普通的凝胶电泳中，电场方向是恒定的，大于50 kb的DNA分子移动速度相近，不同分子的DNA很难分离形成足以区分的条带。1984年，Schwartz和Centor发明了交变脉冲场凝胶电泳技术。与常规的恒定直流单向电场凝胶电泳不同，交变脉冲场凝胶电泳加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小以及作用时间都在交替地变换着，每次电流方向改变后持续1 s到5 min左右，然后再改变电流方向，反复循环，这种电场称为脉冲式交变电场，这种电泳也称为PFGE。在PFGE中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难，因此小分子向前移动的速度比大分子快。
PFGE可以用来分离大小从10 kb到10 Mb的DNA分子，也可以应用于通过细胞的包埋电泳来分离真核生物的染色体。PFGE可以对人类染色体内切酶物理图谱分析，并将大片段DNA分子直接克隆，是人类基因组序列测定工程中有效的方法之一；还可以探测细胞染色体上百万碱基对以上的基因组DNA的缺失；适于单向电场电泳难以分辨的DNA物理图谱的制作等。
琼脂糖凝胶中电泳主要是利用分子筛的效应来分离DNA，普通的恒定直流单向电场凝胶电泳使DNA分子在凝胶中泳动的受力和方向都不发生变化，大分子DNA分子在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行才能通过凝胶，此时，大分子DNA（大于20 kb，有些情况大于40 kb）通过凝胶的方式相同，分子筛效应相同，迁移率无差别（也称“极限迁移率”），从而影响凝胶电泳分离大于20 kb的大分子DNA片段的效果。
PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化，与小分子的DNA相比，大分子DNA需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率变慢，从而达到了分离大分子DNA的目的。
PFGE正是基于不同DNA大小的差异来分离不同DNA分子。在交变脉冲电场中，线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子大小大致成正比，大分子线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长，因为前者变形能力低于后者。当某一线性DNA在脉冲场中改变形状、调整方向、进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，DNA的迁移速度将减为最低。当DNA分子变形、转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA相对分子质量成反比。因此，根据被分离DNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形、转向、泳动，不同大小的DNA就被分离。在普通的凝胶电泳中，DNA走过的路线是直线的；在PFGE中，DNA走过的路线是“之”字形的，但其净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔，略弯。
影响PFGE分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强PFGE对大小差异较大的DNA样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的DNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的DNA分子。
Schwartz等最先设计的脉冲电场凝胶电脉装置采用了交变脉冲垂直定向电场和线电极，但由于其产生的电场不均一，导致其分辨力降低。为此，人们又研制出多种其他脉冲电场电泳装置。具有比较典型特征的类型有以下几种：
（1）反转电场凝胶电泳（field inversion gel electrophoresis,FIGE）。
这种电泳舍弃了电场垂直或正交排列，交变电场均一，并且是180°反向的，从而使DNA沿相当笔直的轨迹运动，应用微处理机增加电泳时脉冲的绝对长度并保持正反向脉冲的比例不变，可使分辨力达到最大，能分辨长达200 kb的DNA片段。
（2）钳位均匀电场电泳（contour-clamped homogeneous electric field,HCEF）。
这种电泳中，由多个在水平凝胶的周围、沿正方形或正六边形排列的电极产生电场，这些电极都被钳制在预定的电位上，正方形排列的电极所产生的电场互为90°，正六边形排列的电极产生的电场则随凝胶的位置和电极极性不同而互成120°或60°，在特定的条件下有可能分辨长达5000 kb的DNA分子。
（3）正交交变电场凝胶电泳（orthogonal field alternating gel electrophoresis,OFAGE）。
正交交变电场中，两交变电场的电流方向相互垂直。OFAGE可用于超螺旋、疏松及线性同等DNA分子的分离，理论上它可以在合适的电泳条件下明显地分离和区别这三种DNA。
五、DNA琼脂糖电泳的回收
在DNA克隆操作中，经常需要通过琼脂糖凝胶电泳分离出目的DNA片段，然后再用凝胶回收。由于琼脂糖中的酸根和羟基多糖等物质对多种工具酶都有抑制作用，因此，从琼脂糖凝胶回收DNA包括了DNA的电泳分离和纯化两方面。
近年来，琼脂糖特别是低熔点琼脂糖的纯度有了很大的提高，有些高纯度低熔点琼脂糖可以在凝胶中直接完成DNA的酶切和连接反应等酶促反应。高纯度低熔点琼脂糖电泳后，将含有DNA条带的琼脂糖切下，于65℃保温熔化，再自然冷却到室温就可以直接在熔化的琼脂糖-DNA混合物中加酶，进行后续实验，还可以在凝胶中进行各种酶促反应。这种方法反应条件温和，非常适合大片段DNA的回收。缺点是高纯度低熔点琼脂糖价格较昂贵。
随着商品化的DNA凝胶回收试剂盒普及，也使得从琼脂糖凝胶回收DNA片段变得更加简便，而且回收率高。DNA凝胶回收试剂盒，对300 bp～10 kb的DNA片段回收效率较高，对一些较大或者较小的DNA片段可能效果较差。总之，从琼脂糖凝胶回收DNA技术仍然是分子生物学中一种重要的技术，应根据自己的实验要求选择合适的回收方法。
由于胶回收的质量和数量直接影响后续的一系列实验——比如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等，所以从琼脂糖凝胶回收目的DNA片段最基本的要求就是保证回收质量和回收率。
回收产物的质量主要指纯度和完整度。普通级别的琼脂糖的硫酸根和羟基多糖等物质对多种工具酶都有抑制作用，在回收过程中，如果这些物质残留过多会强烈抑制后续的连接、酶切或者标记、扩增等实验。此外，极微量的纯化介质或混入回收产物中的某些试剂也会对结果产生严重的影响。对于大片段DNA回收，还要考虑DNA完整度，在回收过程中，机械剪切力可能会使回收产物断裂而出现DNA大小不一致。
回收率是指回收得到目的DNA片段的得率，关系到回收得到的目的DNA的量，对于样品量较小的DNA回收率就显得更为重要了。无论是采取常规的回收方法还是试剂盒回收方法，都会使部分目的DNA片段受到损失，因而尽可能多地回收电泳凝胶条带中的目的片段，提高产物得率，对于后续实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片段越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；上样DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低，因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。影响琼脂糖DNA回收率有两个关键因素：
第一，琼脂糖的质量。琼脂糖的质量影响到DNA分子的回收率，低熔点琼脂糖高于普通琼脂糖，高纯度琼脂糖高于普通琼脂糖，割胶越少回收率越高。
第二，回收目的DNA片段的分子大小。DNA片段分子太大或太小都会影响其回收率，当大于20 kb或小于100 bp时，回收率都是明显降低的。
需要注意的是，目前常用柱式胶试剂盒对小片段和大片段DNA的回收率都较低，小片段的DNA分子和纯化膜的结合力较差，导致回收率低；而超过10 kb的大片段DNA，由于与纯化膜的结合力过强，不容易被洗脱下来，在离心过柱时可能被“扯断”，因此常规的离心过柱的方法并不适合大片段DNA的回收。大片段DNA，特别是大于30 kb的DNA片段的回收，可以采用经典的胶回收方法。
（1）低熔点琼脂糖回收法。
传统的低熔点琼脂糖回收法有挖块法和直接法，由于早期低熔点琼脂糖较昂贵，所以一般是用挖块法回收DNA。即首先进行普通的琼脂糖凝胶的电泳，在长波紫外光下观察DNA电泳状况，当电泳到一定区间时，在DNA条带前面的凝胶上挖一个小孔，将熔化的低熔点琼脂糖倒入小孔补平，继续电泳，待DNA条带进入低熔点琼脂糖后，切下含有DNA的低熔点琼脂糖，加入5倍体积的TE溶液，在65℃熔解低熔点琼脂糖；然后分别用饱和酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；再用乙醇和醋酸铵来沉淀DNA；用70%乙醇漂洗后风干，用水溶解即得回收的目的DNA片段。含有DNA的低熔点琼脂糖胶块也可以用琼脂糖酶来处理，其反应条件更温和，但琼脂糖酶的价格高，而且琼脂糖酶只适合纯度较高的低熔点琼脂糖。
目前DNA胶回收试剂盒已经非常普及，不需要低熔点琼脂糖，不需要有机溶剂抽提，实验步骤也十分简单。大多数试剂盒都可以用于普通琼脂糖中DNA的回收，DNA在普通琼脂糖中电泳，然后在紫外灯下切下含有DNA条带的胶块，利用试剂盒附带的溶液和柱子来纯化目的DNA片段，但其回收的纯度和回收率稍低于低熔点琼脂糖，对连接率和回收量要求较高的最好使用高纯度的低熔点琼脂糖。
低熔点琼脂糖直接法的实现得益于高纯度低熔点琼脂糖产品的出现，其回收步骤更简单，电泳后，直接将条带切下65°保温熔化，然后可以直接在熔化的琼脂糖-DNA混合物中加酶进行后续实验。低熔点琼脂糖直接法不需要经过DNA抽提，减少抽提过程的DNA损失，非常适合大片段DNA的回收，但是这种高纯度低熔点琼脂糖产品，所谓的GTG就是遗传技术级琼脂糖，价格仍较昂贵。
（2）电洗脱法。
电洗脱法一般是将电泳分离后含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的DNA会从凝胶中电泳出来并进入透析袋中，由于DNA分子大（一般用于＞5 kb的片段），不能透过透析袋，保留于透析袋中。取出透析袋中含DNA的溶液，用乙醇沉淀或者进一步用酚/氯仿抽提纯化后用乙醇沉淀。这种回收方法效率较低，只适合用于大片段和量较大的DNA的回收，也是传统手工操作DNA回收方法之一。
（3）试剂盒法。
目前的回收试剂盒都是属于洗脱型回收法，它用能吸附核酸的特定膜或者填料来代替有机溶剂的抽提，回收率可以达到70%～90%。目前商品化的试剂盒种类非常多，根据其吸附核酸的材料不同可以分为膜式回收试剂盒和玻璃奶纯化填料胶回收试剂盒。
膜式回收试剂盒操作简单快速，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解缓冲液彻底溶解，加到有能吸附DNA纯化膜的纯化柱中，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱，得到的纯化产物溶液可以直接用于后续实验。柱回收试剂盒回收快速、简单，结果稳定，整个过程不需要什么技巧，大约10 min就可以完成纯化过程，因而是目前商品胶回收试剂盒使用最多的方法，但是这个方法更适用于0.5～15 kb的DNA片段的回收。
与柱回收试剂盒相比，玻璃奶纯化填料胶回收试剂盒可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。玻璃奶纯化填料胶回收试剂盒的操作步骤基本上和膜式胶回收试剂盒一样，将电泳凝胶的条带切下，用溶胶缓冲液溶解，然后加入玻璃奶纯化填料混合，使其吸附DNA，快速离心沉淀弃上清液，再洗涤一次沉淀，风干沉淀，最后用洗脱液将DNA片段从纯化介质中释放出来，再离心取上清液，就可以得到回收的DNA。这个方法适合不同大小的片段，特别是大片段的回收，但是操作较前者复杂一些，涉及多次离心沉淀和取上清液，有可能会误吸了微量的沉淀；另外对沉淀的干燥程度也有点技巧，干燥过度则不好洗脱，干燥不够会残留有机溶液，影响回收的纯度。针对这一缺点，目前已经有了改进版的玻璃奶纯化填料胶回收试剂盒，它结合了柱回收的优点，把混合了玻璃奶纯化介质的凝胶溶解液加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层溶液可以通过而玻璃奶不能通过的过滤膜，这样离心后，溶液被去除，结合有目的DNA的玻璃奶填料留在柱子里，再利用洗脱缓冲液进行离心洗脱得到目的DNA。这种试剂盒避免了单纯用玻璃奶纯化填料所遇到的问题。只是因为实验操作较复杂，普及不如膜式的胶回收试剂盒。
需要注意的是，不同的厂家的核酸提取或者回收试剂盒采用的纯化材料和试剂不完全相同，回收质量和回收率会有一定的差异，特别是回收小片段和大片段DNA，所以应该根据自己的实验要求并借鉴他人的使用经验来选择合适的回收试剂盒，如果试剂盒不能达到实验目的，应该考虑经典的回收方法（表2-6）。
表2-6 试剂盒对不同大小的DNA的回收率
（1）二氧化硅。
在离液盐（如硫氰酸钾溶液、NaI、NaClO4）的条件下，二氧化硅可以同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以从滤膜中释放出来，蛋白质和其他杂质不会被吸附，从而达到纯化核酸的目的，可以用于RNA和DNA的提取。将二氧化硅制成硅胶膜后，使用更为方便，而且成本低，目前大多商品试剂盒都是采用硅胶膜作为纯化DNA的介质。但是当硅胶膜质量较差时，在洗脱过程脱落的痕量二氧化硅会抑制PCR反应，目前随着膜技术的发展，硅胶膜的质量也得到了很大的提高，这一问题也得到改善。
（2）氧化铝。
氧化铝对核酸有很好的吸附作用，其制成的多孔氧化铝膜（aluminum oxide membranes,AOM）是一种良好的核酸提取基质，是二氧化硅的替代物而且也不会抑制PCR，但缺点是较硅胶膜的成本高。
（3）玻璃粉或玻璃珠。
玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂，特殊玻璃粉经化学处理制成的玻璃奶悬浮液，能高效、快速吸附DNA，在高盐溶液中，核酸可被吸附至玻璃基质上，离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA与玻璃基质的结合。在该方法中，细胞在碱性环境下裂解，裂解液用醋酸钾缓冲液中和后，直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板，被异丙醇沉淀的质粒DNA结合至玻璃珠，用80%乙醇抽真空洗涤，除去细胞残片和蛋白质沉淀，最后用含RNase A的TE缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA，获得的DNA可直用于后续的各种酶促反应。
（4）磁珠。
磁珠是无孔、单分散度、聚苯乙烯和二乙烯基构成的超级磁性颗粒，不同类型的磁珠在其表面共价结合有不同基团（—OH-、≡NH、OH（NH2）COOH等），用于共价连接蛋白和核酸配体，其纯化原理类似于玻璃奶的纯化方式。也有预先共价连接链霉亲和素的磁珠，可将任何生物素标记的核酸或蛋白吸附在表面；还有的将磁珠用特异性的寡核苷酸探针标记，用于吸附和分离提取特异性的核酸片段，这种方法专一性强，提取纯度高。磁珠纯化核酸操作较烦琐，成本也较高，多用于纯化mRNA，如利用结合了Biotin-Oligo（dT）探针的磁珠能专一地吸附含有poly（A）结构的mRNA。
①增加电泳时的DNA上样量。
②切胶时保证胶块包括完整的DNA条带前提下，尽量减小胶块的体积。
③把切下的两块或多块胶熔化后，无论多大的体积都用一根管子，转移到同一个柱子上。
④溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要超过750μL。
⑤溶胶溶液的盐浓度、酸碱性和疏水性影响着DNA与柱子吸附材料的结合，是影响胶回收的关键因素。因此，如果电泳缓冲液的pH偏高，可在溶胶液中加入10μL（pH 5.0，3 mol/L的NaAC）。
⑥为了提高膜对DNA分子吸附力，可以在加热熔化胶后的液体里添加30%异丙醇，对于提高小片段DNA的回收率更有效。
⑦加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10 min），以使乙醇充分挥发。
⑧最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用20～50μL洗脱液洗脱。
⑨在加入洗脱液之后，可以在55℃水浴5 min以上再洗脱以提高回收率。
⑩将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。
六、DNA琼脂糖电泳的注意事项
配制凝胶的浓度据实验需要而定，一般在0.8%～2.0%之间，尽量根据实际需要的量来配制。用微波炉加热熔化琼脂糖的时间不宜过长，否则会因水分蒸发导致凝胶浓度增高。没用完的凝胶可以再次熔化，但随着熔化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。为了防止这种现象，对凝胶浓度要求较为准确的可以在溶胶前称重，溶胶后补充水至原重量。
一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，用于制备不同大小的胶孔来满足不同电泳目的的要求，如大胶孔适用于DNA片段回收实验，小胶孔适用于PCR产物、酶切产物鉴定等。一般来说，根据上样量尽量选择最小的胶孔，得到的电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，以免拔梳板时损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。
上样的样品需要和上样缓冲液充分混匀，上样缓冲液储存液一般为6×或10×，表示其浓度为工作浓度的6倍或10倍，使用时上样缓冲液应稀释到1×的浓度。制备好琼脂糖凝胶后将凝胶放到缓冲液中，使缓冲液浸过胶面，并使梳孔充满缓冲液；梳孔不能有气泡存在，以免影响加样，甚至影响电泳带型；然后利用移液器在胶孔上方小心将DNA样品加到孔中，利用上样缓冲液的沉淀作用将样品沉到孔中。注意吸头不要接触到凝胶，否则造成胶孔损坏，影响DNA的电泳带型。切记，不可先上样再加电泳缓冲液，以免缓冲液冲走样品或引起胶孔之间样品交叉污染。
将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，上样一段靠近负极，使样品从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 V/cm（此处长度指的是正负电极之间的距离），根据实验需要也可作适当调整，增高电压，可缩短电泳时间，但核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，降低电压，电泳时间较长，但核酸条带整齐清晰。为保持电泳所需的离子强度和pH，要注意更新电泳缓冲液，在进行电泳的过程中，溴酚蓝有可能会变黄，这是由于电泳液使用过久或残留在电泳液中的凝胶变质引起的。要特别注意，回收DNA的电泳要全部换新的电泳缓冲液。
微型凝胶和中型凝胶槽只能装少量的缓冲液，比较大的电泳槽更容易减弱缓冲液的缓冲能力，所以应该优先考虑用缓冲能力更强的TBE缓冲液。