第二节 影响核酸电泳的因素
带电的核酸分子在一定的电场下，其迁移速率受多种因素的影响，主要因素有以下几方面：
一、核酸分子大小和构型
从U=αQ/（6πrη）公式中可以知道，影响电泳中核酸分子移动速率的因素包括核酸分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，电泳移动速率越快，但是由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相对分子质量相同的双链DNA几乎具有等量的电荷密度，即使相对分子质量不同，核酸分子的电荷密度差异也不大，所以核酸分子的电荷密度对电泳移动速率的影响不明显，例如，对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。
在一定的电场强度下，电泳中DNA分子的迁移速度主要取决于凝胶对核酸分子的分子筛效应。分子筛效应与DNA分子本身的大小和构型有关，对线形的核酸分子来说，核酸分子的迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比关系。
在正常的电泳条件下相对分子质量相同但构型不同的质粒（plasmid）DNA分子，电泳移动速率的大小顺序为：闭环质粒分子（ccDNA）＞线性质粒分子（LDNA）＞单链开环的质粒分子（ocDNA），但是由于质粒在电泳的移动速率还与提取质粒的状况、琼脂糖浓度、电场强度、EB和缓冲液有关，如果在非正常电泳的条件下有可能会出现相反的情况。一般来说，相对分子质量在10 kb以下的质粒在较低浓度的琼脂糖凝胶上电泳，质粒DNA的迁移速度比相对分子质量相同的线性分子快20%～30%。凝胶电泳正是利用这一特点不仅可分离相对分子质量不同的DNA分子，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。
二、凝胶的类型和浓度
凝胶的类型及浓度对核酸电泳的影响主要是通过分子筛效应的影响，琼脂和聚丙烯酰胺都可以通过浓度的改变来制成筛孔大小各异的凝胶，在筛孔大的凝胶中，核酸迁移速度快，筛孔小的迁移速度慢。不同的凝胶及浓度不同，筛孔的数目也不同，产生的分子筛效应不同。
DNA的迁移率与凝胶浓度的关系可用公式
logU=logUoKrT
表示。U：迁移率；Uo：DNA的自由电泳迁移率；T：胶浓度；Kr：介质阻滞系数，它是与凝胶性质、样品相对分子质量、形状等有关的常数。由此可见DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度呈线性关系，同一DNA分子的迁移速度在不同浓度的凝胶中各不相同，因此凝胶浓度的选择取决于要分离DNA分子的大小。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度的凝胶，达到可以分离不同相对分子质量核酸分子的目的。在琼脂糖凝胶电泳中，分离小于0.5 kb的DNA片段所需胶浓度是1.2%～1.5%，分离大于10 kb的DNA分子所需胶浓度为0.3%～0.7%，DNA片段大小在两者之间则所需胶浓度为0.8%～1.0%；在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，分离小于30 bp的DNA片段所需胶浓度是15%～20%，而大于0.5 kb的DNA片段所需胶浓度是2%～2.6%。琼脂糖凝胶浓度的选择大致可参考表2-3，需要注意的是不同厂家生产的琼脂糖其纯度不一样，对电泳也会产生不同的影响。聚丙烯酰胺凝胶的筛孔主要是由Acr与Bis的相对比例决定，还受到凝胶浓度的影响，其浓度的选择可参考表2-4来选择。
表2-3 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围
表2-4 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的分离范围
三、电场的电压和方向
在低电压时，核酸分子的迁移速率主要受分子筛效应的影响，而受分子的电荷效应影响较小，因此在较低电压和相对分子质量较小的核酸分子电泳时，线状核酸分子的迁移速率与所加电压成正比。随着电场强度的增加，核酸分子的迁移率受电荷效应影响也会加大，表现出相对分子质量不同的核酸分子的迁移率的增加幅度是不同的，相对分子质量越大的片段，随着电压升高引起的迁移率升高幅度也越大，由此可见增加电压可以使凝胶的有效分离范围缩小。例如，在琼脂糖凝胶电泳中，要使大于2 kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不应超过5 V/cm；分离50 kb以上大分子的DNA片段，采取较低的电压（0.5～1.0 V/cm）和较长的琼脂糖凝胶才能取得很好的分离效果。需要注意的是，在5 V/cm的场强下虽能得到结果，但分辨率不高，因此在需要精确测定DNA分子大小或要求高的分辨率时，应降低电泳的电压至1 V/cm，并适当延长电泳距离和时间。
如果电场方向是恒定的，大于50～100 kb的DNA分子在琼脂糖凝胶上迁移速率几乎是相同的，也就是说此时无法分辨DNA的大小，所以在真核生物总DNA电泳时只能看到一条DNA条带，而看不到不同的染色体条带。如果电泳的电场方向周期性改变，则DNA分子的移动方向被迫周期性改变，经过的路径也更大，由于相对分子质量大的DNA分子，适应新的电场方向所需的时间长，通过脉冲电场就可以分辨相对分子质量更大的DNA分子（达到10000 kb）。用于大片段DNA分离的脉冲电场电泳有以下两种电泳方式：倒转电场凝胶电泳（FIGE），用于分离10～2000 kb的DNA分子；钳位均匀电场电泳（CHEF），可分离大于10 Mb的DNA分子。通常，脉冲电场电泳用以鉴定、分离制备大于50 kb的DNA大分子。
四、电泳缓冲液的离子强度
为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及电泳环境pH的稳定性，电泳缓冲液通常要保持一定的pH和离子强度。电泳缓冲液的离子强度一般在0.02～0.2mol/L，离子强度过低不仅缓冲能力差，还会导致电流太小，电泳缓慢，如果用蒸馏水配制凝胶和电泳，DNA几乎不移动；离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，使得DNA分子的移动速率降低。如果误用没有经过稀释的电泳缓冲液的母液来制胶和电泳，在高离子强度的缓冲液中，不仅DNA分子电泳缓慢，而且电导率高，导致电流过大，产生大量的热量，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性，另外高离子强度缓冲液的黏度也会对电泳速度产生影响。
使用稀释倍数过大的缓冲液进行电泳，DNA电泳条带的带型会变粗且松散；如果用稀释倍数不够的缓冲液来制胶，电泳都表现为使DNA分子电泳变得缓慢，如用2×TAE或者1×TBE来作为电泳缓冲液，会导致DNA的移动速率降低，但是得到的DNA条带带型会更紧凑。因此在进行DNA杂交实验中，为了使带型更紧凑，提高分辨力，可以用2×TAE或者1×TBE，但电泳需要在更低电压的条件下进行，并延长电泳时间。
五、核酸染料
EB是核酸电泳中最常用的染料，它会嵌入到核酸堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15%。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB的质量浓度为0.1～0.5 g/mL，即电泳时所加的浓度。由于EB嵌入碱基会使超螺旋DNA解链，使迁移率下降，同时由于电荷的中和，也会影响到DNA的迁移，其对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。一般的电泳可以忽略EB对电泳的影响，而对于特殊电泳，为了更为准确地比较DNA的相对分子质量，最好在无EB的状况下电泳，电泳完毕再进行染色。
需要注意的是，由于EB是带正电的分子，在电场中向负极移动，如果在凝胶中或者电泳缓冲液中添加EB，长时间电泳后，正极的EB浓度升高，背景加深，而负极EB浓度降低，背景降低，拍出来的电泳图像中胶的正负两端背景差异很大。
目前除了EB外，还出现多种可以代替EB的无毒化学染料，不同的染料对电泳DNA条带的影响有所不同，不同染料在不同的电压与不同载样量下对电泳的带型扭曲程度、分辨率以及带型的影响也有所不同，所以在使用上要注意积累一定的经验。为了避免染料对电泳中DNA条带的影响，最好采用电泳后再染色的观测方法。
六、样品组分和加样量
与其他的电泳一样，核酸电泳同样会受到样品组分的影响。如果提取的DNA纯度太差，含有较多的蛋白质或多糖类物质，可能会使DNA滞留在胶孔中；如果样品里含有较高的盐浓度，会拖慢DNA的迁移并使邻孔内的DNA产生变形条带；同一样品使用不同的溶液溶解或上样，也会影响电泳时DNA的迁移速度，得到不同的电泳带形。
加样量一般是根据加样孔的大小、DNA片段大小和需要加样量的多少来确定，当加样孔大时需要的DNA加样量也要相应加大，否则会造成DNA电泳条带过浅，甚至看不到电泳条带。相反，加样孔小时可以适当减少样品的加样量。需要注意的是，即使加样孔够大，加样量过多会造成胶孔的超载，从而导致电泳的条带拖尾或者弥散达不到分离的目的，对于大片段的DNA影响更大。一般每一个制胶模具均配有多个齿型大小不同的梳板，梳板齿宽厚则形成的加样孔体积大，梳齿窄薄则形成的加样孔体积小，梳板的选择主要根据加样体积来确定，一般来说，当加样量小时尽量选择薄的梳板，这样获得电泳条带清晰，便于照相和结果分析。
七、上样缓冲液
电泳样品需要按一定比例和上样缓冲液混匀后再加到胶孔中，上样缓冲液主要由指示剂和沉淀剂组成。指示剂常用的有溴酚蓝和二甲苯青FF，沉淀剂常用30%甘油或40%蔗糖，有些上样缓冲液含有10 mmol/L的EDTA,EDTA可以螯合Mg2+，防止电泳过程中DNA被降解。使用上样缓冲液有三个作用：第一，增大样品密度，以确保DNA均匀沉淀到胶孔；第二，使样品带颜色，使加样容易；第三，通过指示剂可以判断电泳进程（参见表2-1，表2-2）。
上样缓冲液不会对电泳的迁移率产生影响，不同的凝胶或者不同的核酸电泳会采用不同上样缓冲液。选用哪一种指示剂纯属个人喜好，但是，不同的凝胶电泳使用的缓冲液成分也有所不同，所以应根据实验中电泳凝胶的类型和核酸类型来选择相应的上样缓冲液，如在RNA甲醛凝胶电泳中要使用甲醛凝胶加样缓冲液，而用碱性凝胶时应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下，其显色较溴酚蓝更为鲜明。目前有些商品化的上样缓冲液会添加一定浓度的SDS（十二烷基硫酸钠），其目的是减少蛋白质对DNA电泳的影响，而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可有效减少DNA条带的弯曲和拖尾现象。
八、其他因素
除了以上常见的主要影响因素会影响到电泳之外，还有一些其他容易被忽略的因素也会影响到电泳的结果，如温度和电渗等都会对电泳产生一定的影响。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si—OH基团，在pH＞3时，这些基团电离会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。这时可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心，以观察电渗的方向和距离。聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳比琼脂糖水平电泳更容易受电渗的影响，所以在进行长度较大的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，一般先用硅烷溶液处理玻璃板再制胶，这样不仅可以使制胶更容易，能减少电渗的影响，还可以使电泳完毕后卸胶时更容易，减少凝胶破裂的可能性。
正常的温度对电泳的影响不大，但是温度过高会影响到溶液的黏度，特别会使介质黏度降低，分子运动加快，引起自由扩散变快，迁移率增加。电泳中产生的热通常是由中心向四周散发的，所以介质中心温度一般要高于四周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于四周部分黏度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大。由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓形。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加，影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。一般的电泳温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响，通常电泳可在室温下进行。只有当凝胶浓度低于0.5%或者使用低熔点琼脂糖凝胶时，为增加凝胶硬度，防止电泳产生的热量融化凝胶，可在低的温度条件4℃进行电泳。但是在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，为了保持凝胶对双链DNA的变性作用，保证单链DNA的分离效果，则需要在较高的温度（60℃左右）条件下进行电泳。
凝胶厚度也会对电泳产生影响，如在琼脂糖凝胶电泳中，小于5 mm时，凝胶太薄，凝胶易碎，还会导致加样孔太小，造成加样的困难和样品之间容易污染；大于7 mm时，凝胶太厚，不但会浪费琼脂糖凝胶，还会造成核酸泳动速度慢，电泳需时长，条带松散不清楚，易造成拖尾现象，不易于观察。
此外，还有电泳装置的质量也会对电泳产生一定的影响，如铂金丝太细会导致电泳变慢，不平直会影响到带型的平整。太小的电泳槽，由于缓冲液少而缓冲能力差，不适合长时间电泳。垂直电泳对电泳槽的质量要求更高，玻璃板侧面漏电会容易形成“八”字形的电泳带型，对于大于1000 V以上的高压电泳（如变性PAGE的测序电泳）影响更大，这时用硅烷溶液处理玻璃板就更重要了，此外还有上下槽的绝缘率等都会对电泳产生一定的影响。