5.2　荧光与分子结构的关系

5.2.1　荧光效率和荧光寿命

能产生荧光的分子称为荧光分子。能产生荧光的分子必须具备的条件包括：

①具有合适的结构　荧光分子通常为有强紫外-可见吸收的苯环或稠环结构的有机分子，如荧光素、联苯、芴。

②具备较高的荧光效率　荧光效率又称荧光产率，是指物质分子发射荧光的光量子数与吸收激发光的光量子数之比，常用ϕf表示：

　　（5-1）

荧光效率0≤ϕf≤1。ϕf =1表示每吸收一个光量子就发射一个光量子，但大部分荧光物质ϕf<1。例如荧光素钠在水中ϕf=0.92；荧光素在水中ϕf=0.65；蒽在乙醇中ϕf =0.30；菲在乙醇中ϕf= 0.10。荧光效率越低说明该物质虽然有较强的紫外吸收，但所吸收的能量多以无辐射跃迁形式释放，所以荧光强度弱。

荧光寿命指激发光除去后，分子荧光强度降至最大荧光强度的1/e所需的时间，常用τf表示。物质被激发时的荧光强度（F0）和除去激发后t时间的荧光强度（Ft）呈指数关系，具体见式（5-2）：

Ft=F0e-kt　　 （5-2）

式中，k为衰减常数。当时，t=τf，代入式（5-2）得：

　　（5-3）

将式（5-3）代入式（5-2）得：

　　（5-4）

以ln对t作图，斜率的倒数为荧光寿命。利用分子荧光寿命的不同，可进行混合荧光物质的分析。

5.2.2　荧光强度与结构的关系

物质分子结构不仅与是否有荧光的发生有关，还与荧光强度密切相关，因此可以根据物质的分子结构判断其荧光特性。化学结构与荧光强度之间的规律如下：

（1）跃迁类型

分子结构中具有π→π*跃迁或n→π*跃迁的物质都有紫外-可见吸收，但n→π*跃迁引起的R带是一个弱吸收带，电子跃迁概率小，由此产生的荧光极弱。发生π→π*跃迁的分子其摩尔吸光系数比n→π*跃迁大100～1000倍，激发单线态与三线态间能量差别比n→π*跃迁大很多，电子不易自旋反转，体系间跨越概率小，因此实际上分子结构中存在共轭的π→π*跃迁的分子荧光效率高，强度大。

（2）共轭效应

绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭（π→π*）体系。共轭体系越长，荧光强度（荧光效率）越大，其和产生红移。如苯、萘、蒽三个化合物的共轭结构与荧光的关系如下：　

　　对共轭环数相同的芳香族化合物，线性环结构的荧光波长比非线性的要长。如菲和蒽共轭环数相同，菲为角形结构，为350nm。

含有长共轭双键的脂肪烃也可能有荧光，但这一类化合物的数目不多。维生素A是能发射荧光的脂肪烃之一，结构式如下：

（3）刚性和共平面性效应

荧光分子具有刚性平面结构，可降低分子振动，减少与溶剂相互作用，具有较强的荧光。刚性、共平面性变大，荧光效率增大，荧光波长红移。如酚酞和荧光素结构相似，荧光素多一个氧桥，使分子的3个环成一个平面，分子的刚性和共平面性增加，电子的共轭程度增加，因而荧光素有强烈的荧光，但酚酞却较弱。联苯和芴的荧光效率ϕf分别为0.18和1.0，二者的结构差别在于芴的分子中引入亚甲基成桥，使两个苯环不能自由旋转，刚性和共平面性增加，荧光效率大大增加。

荧光素　　　　　　酚酞

本身无荧光或发生较弱荧光的物质，与金属离子形成络合物后，若刚性和共平面性增强，则可产生荧光或荧光增强。如弱荧光物质8-羟基喹啉与Mg2+形成络合物荧光强度增强。

（4）取代基效应

芳环上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都产生很大影响，取代基可分为三类：

①取代基增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长红移。取代基包括：—NH2、—OH、—OCH3、—NHR、—NR2、—CN等供电子基。如苯胺、苯酚的荧光强度是苯的50倍。

②取代基减弱分子的π电子共轭体系，使荧光减弱甚至熄灭。取代基包括：—COOH、—NO2、—CO、—NO、—SH、—NHCOCH3、—X等吸电子基。如硝基苯、苯甲酸、溴苯是非荧光物质。

③取代基对π电子共轭体系作用较小，对荧光影响不明显。取代基包括：—R、—SO3H、—N等。

（5）空间位阻效应

取代基空间位阻对荧光强度也有影响。在荧光物质分子中引入了较大基团后，由于位阻的原因分子的共平面性下降，则荧光减弱。例如，1-二甲氨基萘-8-磺酸盐中的二甲氨基与磺酸盐之间的位阻效应，使分子发生了扭转，两个环不能共平面，因而使荧光大大减弱。

同理，由于立体异构造成的空间位阻对荧光强度也有显著影响。如1，2-二苯乙烯的反式异构体有强荧光，而顺势异构体没有荧光。原因是顺式分子的两个基团在同一侧，空间位阻使分子不能共平面而没有荧光。

5.2.3　影响荧光强度的外界因素

分子所处的外界环境，如温度、溶剂、pH值、荧光猝灭剂等都会影响荧光效率，甚至影响分子结构及立体构象，从而影响荧光光谱的形状和强度。

（1）溶剂的影响

溶剂对荧光的影响称为溶剂效应，是影响荧光光谱形状、强度、位移的重要因素之一。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而红移，荧光强度也有所增强。这是因为极性溶剂使π→π*跃迁所需的能量差降低，跃迁概率增加，从而使红移，强度增强。同理，增加溶剂的非极性可使蓝移。另外溶剂黏度增加可降低溶质分子间碰撞概率，无辐射跃迁减少，荧光强度增加。表5-1为8-巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰位及荧光效率。

（2）温度的影响

随着温度的升高，分子运动速度加快，溶剂的弛豫作用减小，荧光物质与溶剂分子的碰撞频率增加，外转换概率增加，荧光效率下降，荧光强度将降低。例如荧光素钠的乙醇溶液在0℃以下，温度每降低10℃，ϕf 增加3%，在-80℃时，ϕf 为1。

（3）pH值的影响

当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响。这是因为弱酸（碱）分子与其共轭碱（共轭酸）电子结构有所不同。当溶剂pH值发生改变时，弱酸（碱）主要存在形式不同，因而具有不同的荧光。

大多数荧光物质对溶剂的pH值很敏感，都有最适宜荧光发射的pH值范围，实验时应严格控制。

（4）散射光的影响

当一束平行光照射在液体样品上，一部分光线透过溶液，一部分被分子吸收，另一部分由于光子和物质分子相碰撞，光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。

光子和物质分子只发生弹性碰撞，不发生能量的交换，仅光子运动方向发生改变，其波长与入射光波长相同，这种散射光叫作瑞利光。

光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向改变的同时，光子与物质分子发生能量交换，光子能量增加或减少，而发射出比入射光波长稍长或稍短的光，这种光称为拉曼光。其中长波长光称为Stokes线，而短波长光为反Stokes线，Stokes线比反Stokes线强度大。

瑞利光和拉曼光强度与激发波长有关，一般激发波长越短散射光越强，但拉曼光较瑞利光强度弱。瑞利光波长与激发波长相同，可通过选择适当的荧光波长或加入滤光片消除对荧光测定干扰。拉曼光波长与物质荧光波长相近，对荧光测定的干扰大。可利用拉曼波长随激发波长改变而改变，而荧光波长与激发波长无关的性质，通过选择适当的激发波长将二者区分开。

以硫酸奎宁为例，从图5-4（a）可见，无论激发波长在320nm还是350nm，硫酸奎宁的最大荧光波长总是在448nm。从图5-4（b）可见，用相同的激发波长照射空白溶剂，在激发光波长为320nm时，溶剂的瑞利光波长是320nm，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响。在激发光波长为350nm时，溶剂的瑞利光波长是350nm，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。

表5-2为常用四种溶剂在不同波长激发光照射下拉曼光的波长。从表5-2中可见，四氯化碳的拉曼光与激发光的波长极为相近，所以其拉曼光几乎不干扰荧光测定。而水、乙醇及环己烷的拉曼光波长较长，使用时必须注意。

（5）荧光猝灭剂的影响

荧光物质分子与溶剂分子或其他分子相互作用，引起荧光强度降低或消失的现象称为荧光猝灭。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂。根据荧光猝灭的机制分为动态猝灭（碰撞猝灭）、静态猝灭、转入三重态猝灭、自吸收猝灭。

碰撞猝灭又称动态猝灭，是由于激发态荧光分子与猝灭剂分子碰撞而失去能量，无辐射跃迁回到基态，是引起荧光猝灭的主要原因。碰撞猝灭受扩散控制，服从Stern-Volmmer猝灭方程。当溶液黏度或猝灭剂浓度增加时，猝灭效应降低。静态猝灭是荧光物质与猝灭剂形成不能产生荧光的配合物。静态猝灭可减小激发分子的浓度，改变荧光强度，但不改变荧光寿命。转入三重态猝灭是由于引入高电荷重原子，使荧光分子由激发单重态转入激发三重态后不能发射荧光。这种随着重原子加入而出现的荧光强度减弱而磷光强度增强的现象称为重原子效应。自吸收猝灭是荧光分子浓度增大后，一些分子的荧光发射光谱被另一些分子吸收，造成荧光强度降低。自吸收现象是因为荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱长波长端重叠造成。浓度越大，自吸收现象越严重，故也称浓度猝灭。

O2是最常见的荧光猝灭剂，荧光分析时要除去溶剂中的氧。常见的荧光猝灭剂还包括：卤素离子、重金属离子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。

（6）氢键的影响

荧光物质与溶剂或其他溶质之间形成氢键，能显著影响荧光物质的荧光发射光谱和荧光强度。

（7）表面活性剂的影响

当表面活性剂浓度达到临界胶束浓度时，表面活性剂会聚集形成胶束，然后荧光物质被分散和固定在胶束中，降低了荧光物质之间的碰撞概率，减少了分子的无辐射跃迁，提高了荧光效率，荧光强度增加。另外，荧光物质被分散和固定在胶束中，增强了荧光物质的稳定性，降低荧光猝灭剂对荧光物质的猝灭作用，同时也可降低荧光物质的自猝灭，可提高荧光分析法的灵敏度和稳定性。