实验四　果蝇的双因子杂交实验

【实验目的】

（1）验证并加深理解孟德尔自由组合定律；

（2）记录杂交结果和掌握统计分析方法；

（3）学习分析实验成功或失败的原因等问题。

【实验原理】

自由组合定律又称为独立分配定律（Law of Independent Assortment）或孟德尔第二定律，是指支配2对（或2对以上）不同性状的等位基因，在杂合状态下保持其独立性。配子形成时，各等位基因彼此独立分离，不同对的基因自由组合。在一般情况下，F1代形成4种配子类型，其分离比为1∶1∶1∶1；F2代的基因型分离比率符合（1∶2∶1）2，即（1/4+2/4+1/4）2三项式展开后的各项系数。当显性完全时，F2表型比率为（3∶1）2，二项式展开后的各项系数符合9∶3∶3∶1。因此，可以根据杂交的配子类型及比例，F1代、F2代群体表型及比例，对2对（或2对以上）相对性状的分离和组合进行遗传分析。

双因子遗传是指位于非同源染色体上的两对等位基因的遗传规律。本实验利用果蝇的两对相对性状，分别用长翅对残翅、灰体对黑檀体进行双因子杂交，分析验证其性状遗传规律。其中黑檀体果蝇的体色为乌木色（e），与之相对应的野生型果蝇的体色为灰色（E），灰体对黑檀体为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第3号染色体（70.7cM）上。果蝇另一突变性状为残翅（vg），与之对应的野生型性状为长翅（Vg），控制这对相对性状的基因位于第2号染色体（67.0cM）上，长翅对残翅为完全显性。根据孟德尔自由组合定律，F1代形成配子时，产生4种基因型的配子（EVg、Evg、eVg、evg），其比例为1∶1∶1∶1。在F2代中会出现4种表现型，分别为灰体长翅E_Vg_、灰体残翅E_vgvg、黑檀体长翅eeVg_、黑檀体残翅eevgvg，它们之间的比例符合9∶3∶3∶1。

【实验用品】

1.实验材料

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的残翅品系（EEvgvg）和黑檀体品系（eeVgVg），其中E对e、Vg对vg均为完全显性，且这2对基因没有连锁关系，是位于不同染色体上的非等位基因。

2.实验器具

恒温培养箱、高压灭菌锅、白瓷板、镊子、毛笔、果蝇培养瓶、麻醉瓶、脱脂棉、医用纱布、标签纸、牛皮纸、棉线绳、橡皮筋、酒精灯等。

3.试剂

琼脂、蔗糖、玉米粉、酵母粉、丙酸（装在滴瓶中）、乙醚等。

【实验步骤】

1.原种果蝇培养

于杂交实验开始前2周，在25℃条件下分别培养残翅和黑檀体果蝇品系。待每个培养瓶中的幼虫化蛹之后，移去培养瓶中的成蝇，准备挑选杂交亲本。

2.挑选杂交亲本果蝇

选灰体残翅和黑檀体长翅果蝇为亲本，分别做正交和反交组合实验。由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。刚羽化的雌蝇在12h内一般无交配能力，因此在杂交实验开始前放出亲本培养瓶中的所有成蝇，然后每隔6～8h收集一次刚羽化出的成蝇，并将雌雄蝇分开在不同的培养瓶中培养。收集处女蝇数量的多少根据需要而定，通常每组合不少于5只。

3.设计杂交组合，进行麻醉接种

选用残翅品系与黑檀体品系杂交，正反交实验同时进行，即灰体残翅♀×黑檀体长翅♂、黑檀体长翅♀×灰体残翅♂。将所选处女蝇按品系分别麻醉，按不同杂交组合分别选取雌、雄蝇各6～10只移入杂交瓶中，为了防止昏迷果蝇被培养基粘住，可将培养瓶放倒，将果蝇置于瓶壁，待其完全苏醒后再将培养瓶直立，贴上标签（图4-1），标明杂交亲本、杂交日期、实验人姓名。将杂交瓶放在25℃恒温箱内培养。

4.实验观察

（1）培养7天后，当亲本果蝇都已杂交产卵并在培养瓶中出现幼虫时，应及时将亲本移出处死，以防止亲本与F1代成蝇发生回交。再经5～7天后待F1代果蝇大部分已经羽化成成蝇后，将F1代成蝇转到麻醉瓶中进行深度麻醉，并在白瓷板上用解剖镜（或放大镜）观察和记录F1代个体的性状，分别统计正反交实验结果，分析判断F1代个体的性状是否和预期结果一致。观察后的果蝇处死后收集至尸体瓶。

（2）收集正反交F1代成蝇各6～10对，分别移入新培养瓶（不需要处女蝇），贴好标签，写明F1代的基因型、班级、姓名、杂交日期等信息。放到25℃恒温箱内培养7天。当看到培养瓶内大量出现幼虫时，及时将F1代亲蝇移出处死，以防发生回交。

（3）过6～7天，F2代成蝇大量出现后，可进行观察统计。观察并统计F2代的性状表现类型及数目，并将观察结果填入表4-1中。其中正反交F2代成蝇的统计数目要大于200只，已被观察统计过的果蝇要倒入尸体瓶。

【实验数据处理与分析】

（1）观察并统计正、反交F1代、F2代表型及个体数，比较正反交结果，完成表4-1。

注：灰指“灰体”，黑指“黑檀体”；长指“长翅”，残指“残翅”。

（2）根据统计结果，计算不同表型之间的比例，并根据实验统计结果，按实验三的方法进行χ2检验。若所计算的χ2<（查表），说明实验观察数符合理论假设；若所得的χ2>（查表），说明不符合理论假设。

【要点及注意事项】

（1）严格控制挑选处女蝇的时间，挑选的处女蝇最好单独培养2～3天，如果有幼虫出现，说明有非处女蝇混杂。

（2）观察和统计F1代、F2代果蝇时，先对果蝇进行深度麻醉，再进行观察统计。特别是观察翅型时，尽量避免果蝇死亡导致翅膀外展，干扰性状观察。

（3）如果在杂种F1代中就出现性状分离，如残翅或黑檀体果蝇，表明杂交亲本的选择已出现误差。

【作业及思考题】

（1）基因间发生自由组合的前提是什么？

（2）分别针对F2代的雌性和雄性个体进行统计分析，自由组合定律的验证结论是否会有所不同？

（3）如果χ2检验结果不符合自由组合定律，分析其可能的原因。

【参考文献】

[1] 闫桂琴，王华峰.遗传学实验教程[M].北京：科学出版社，2010.

[2] 杨大翔.遗传学实验[M].第3版.北京：科学出版社，2016.

[3] 牛炳韬，孙英莉.遗传学实验教程[M].兰州：兰州大学出版社，2014.

[4] 赵凤娟，姚志刚.遗传学实验[M].第2版.北京：化学工业出版社，2016.

（唐文武　梁盛年）