实验八　动植物细胞减数分裂及染色体行为的观察

【实验目的】

（1）观察减数分裂各个时期的特征及染色体的形态、数目的变化，加深对减数分裂遗传学意义的认识；

（2）学习并进一步掌握动、植物减数分裂玻片标本的制作方法和基本技能；

（3）了解动、植物的生殖细胞的形成过程。

【实验原理】

减数分裂是一种特殊的细胞分裂，仅在配子形成过程中发生。这一过程的特点是：连续进行两次核分裂，而染色体只复制一次，结果形成四个核，每个核只含单倍数的染色体，即染色体数减少一半，所以称作减数分裂。另外一个特点是前期特别长，而且变化复杂，包括同源染色体的配对、交换、分离和非同源染色体的自由组合等。

在高等生物里雌雄性细胞形成的过程中，都是先由有性组织（如花药和胚珠、精巢和卵巢）中的某些细胞分化为孢母细胞（2n），以及精母与卵母细胞（2n）。进一步由这些细胞进行一种连续两次的减数分裂，即减数第一次分裂和减数第二次分裂，最终各自产生4个小孢子（n）或精细胞（n），或是分别产生一个大孢子或卵细胞（n）与三个退化的极体（n）。再经受精作用，雌、雄配子融合为合子，染色体数目恢复为2n。这样，在物种延续的过程中，确保了染色体数目的恒定，从而使物种在遗传上具有相对的稳定性。同时，基因的分离、自由组合以及连锁交换同时通过减数分裂发生，可以说减数分裂是经典遗传学的根本。通过减数分裂的观察，可以详细到染色体的形态、数目、组成和染色体的鉴定和分析等，从而为遗传学研究中远缘杂种的分析、染色体工程中的异系鉴别、常规的组型分析以及三个基本规律的论证，提出了直接与间接的依据和细胞学基础。

遗传学实验中通常以植物的小孢子母细胞或动物的精母细胞为材料观察减数分裂过程。由于大孢子母细胞数量少，制片不易；而动物的卵母细胞不仅数量少，而且进行减数分裂时通常停留在前期Ⅰ很长时间直到性成熟，因此不易观察其他时期的分裂相。在本实验中，我们以玉米及蝗虫为材料制备染色体标本，观察、比较动植物减数分裂过程中染色体的行为。玉米是容易栽培和获取的植物材料，2n=20。蝗虫属于昆虫纲、直翅目、蝗科，全世界广泛分布，容易获取。本实验利用东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis），2n=23。蝗虫染色体大，数目少，在减数分裂过程中染色体的特征比较明显，是进行减数分裂观察的经典材料，但有些分裂相（尤其是减数分裂Ⅱ中的一些分裂相）不易识别。

【实验用品】

1.实验材料

玉米（Zea mays，2n=20）幼穗，东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）精巢（2n=23）。

2.实验器具

显微镜、解剖针、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸、酒精灯、小广口瓶等。

3.试剂

卡诺固定液、45%乙酸、卡宝品红染液（配制方法见附录2）、香柏油等。

【实验步骤】

一、玉米

1.取材

植物进行减数分裂时外部表现为一定的形态特征。玉米最后一片叶刚露出叶尖的一周内，花粉母细胞进入减数分裂期。用手摸植株顶端，有松软感觉的部位就是雄花序所在。用刀片将此处叶鞘纵向划一刀，剥出雄花序检查，花药长3mm左右、呈黄绿色、约占小花一半长度时最合适。如花药黄色则太老，绿色则太嫩。每个小穗内有2朵小花，每朵具有3个花药，第1小花比第2小花嫩，同一朵小花的三个花药几乎处于同一分裂时期。我们一般取较长的花药制片。

2.固定

将取样玉米花序中太老、太嫩的小穗剪除，用卡诺固定液室温下固定2～24h，固定液的量为材料的5倍。固定后的花序用70%乙醇换洗3次，最后一次存放在冰箱中备用。固定的目的是迅速杀死活细胞，同时使染色体的蛋白变性，保持其固有的形态。

3.制片及镜检

从70%乙醇中取出1～2个小穗，用滤纸吸去固定液。用镊子夹出花药摆在载玻片上，加一小滴改良卡宝品红染液浸没花药，然后持解剖针或刀片横切花药，再用针头轻压，挤出小孢子母细胞，静置3～5min。然后利用低倍镜（100×）观察。如观察到的花粉母细胞呈圆形，细胞核的位置可见一小团染色较深的物质；或花粉母细胞呈两个半月形或四个圆锥形，都说明其处于减数分裂期。

初步镜检合格后，用镊子尽可能去除载玻片上的花药壁残片。盖上盖玻片，以两指夹持载玻片的两长边，小心地在酒精灯外焰上过几次（不要烤沸！），然后在显微镜下观察染色是否合适。反复几次，直至合适为止。加热的目的，一是使细胞质膨胀，二是使染色体着色加深。如染色过深，可以在盖玻片边缘注一滴45%的冰乙酸，而在相对的边缘用吸水纸吸收在盖玻片下流动的染色液，直到胞质脱色而染色体仍清晰可见为止。

将好的制片放在水平的台上，覆上滤纸压片，并在油镜（1000×）下仔细地观察染色粒、染色体联会、染色体分离等特征，并鉴定各时期。实验中同学之间可以相互参观和交流，借以扩大观察内容和范围。

二、蝗虫

1.取材

蝗虫以夏秋两季采集为宜。蝗虫雌雄个体有明显的差别，一般雄虫个体较小，雌虫个体较大；在外生殖器形态方面，雄体腹部末端为交配器，形似船尾；而雌体腹部末端上下产卵瓣分叉，与雄体明显不同。

将捕到的雄虫剪去双翅，再由腹部的背面剖开，其中橘黄色的团状结构组织就是蝗虫的精巢。精巢一般成对紧紧贴在一起，外被薄膜，薄膜上含大量脂肪，使整个精巢呈黄色。将精巢投入到0.7%的生理盐水中，剔除脂肪，就可以看到精巢中细小的纤维状曲细精管。

2.固定

将剔除脂肪的精巢投入到卡诺固定液中，室温下固定2～6h，至精巢发白。转入70%酒精换洗两次，并在70%酒精中保存备用。

3.制片及镜检

挑取3～4条曲细精管置于载玻片上。用镊子从曲细精管中间切成两段，弃去后半段（近输精管端，属于转化区内，含大量的成熟精子与精细胞），留下前半段（因为前半段细胞分裂旺盛，易于观察各分裂相）。滴一滴改良卡宝品红染液，同时以小镊子轻轻挤压精细小管外壁，以使性母细胞或减数分裂中各时期的细胞流出精细小管管壁，以利于观察。染色10～15min后盖上盖玻片，用手指隔着吸水纸略加压力，使细胞散开，铺成单层。随后便可放显微镜下观察。

【预期实验结果辨析】

本实验难在看懂一些分裂相，尤其是蝗虫。原因是：①本实验只用普通光学显微镜水平的细胞学证据，难以推断诸如细胞中包含几条染色体等问题；②动物性母细胞分裂后，无法借助子细胞数或邻近细胞染色体形态来判断分裂相是属于减数分裂Ⅰ还是减数分裂Ⅱ；③减数分裂是动态过程，分裂相逐步过渡，有些分裂相之间界限模糊，比较难以确认。

尽管如此，仔细辨别还是能找到将各时期区分开来的特征。可借助减数分裂各时期的典型特征和相关文献来综合判断所观察分裂相所处时期。下面对减数分裂各时期的识别要点做了简要说明，并附上相应的蝗虫和玉米性母细胞减数分裂各时期的典型特征图（彩图8-1，彩图8-2），以供借鉴。

1.减数分裂Ⅰ

（1）前期Ⅰ

①细线期：染色体呈很细的染色线，螺旋卷曲分散在细胞核内，沿着整条染色线分布着许多染色粒，形似念珠，在细胞核内，核仁清晰可见。

②偶线期：同源染色体彼此接近，发生联会。在细线期末、偶线期初，染色体或染色丝在细胞中的部位发生变化。在植物细胞中，染色丝凝集成团，偏于细胞核的一边，称为凝线期，在这一时期，还出现染色质（丝）穿壁转移运动。在动物细胞中，染色丝的一端聚集到核的一侧，而另一端呈放射状扩散，呈花束状，特称花束期。凝线期或花束期一直延续到偶线期结束粗线期开始为止。

③粗线期：同源染色体完成配对，成为二价染色体（或成对的同源染色体），染色体由于螺旋卷曲的结果而缩得很短，每一粗线期的染色体具有两条并列的染色单体，成对的同源染色体含有四条染色单体，称为四分体，核仁附着于特定的染色体上。

④双线期：同源染色体之间彼此开始分离，但是在一个或多个点上互相交叉而又保持在一起，形似麻花。在该期，同源染色体的两个染色单体之间发生交换。

⑤终变期：染色体缩得更短，交叉移向染色体的中间或末端，呈现V形、8形、O形或X形。染色体常移到核的周围靠近核膜的地方，是统计染色体的最好时期。该期结束时，伴随着核膜的破裂和核仁的消失。

（2）中期Ⅰ　核膜和核仁已消失，染色体排列在赤道面上，两极出现纺锤体并与染色体的着丝点相连。此时所有的四分体都排列在纺锤体的中部，但并不发生着丝点的分裂现象，与有丝分裂不同。

（3）后期Ⅰ　每个四分体中的两个同源染色体，由于着丝粒的作用而彼此分离，逐渐向两极移动，形成两组染色体。

（4）末期Ⅰ　当两组染色体移动到两极后又聚集起来，核膜重新出现。在第一次核分裂之后，有些物种紧接着就进行胞质分裂，如百合、洋葱等，但有些物种则不接着进行胞质分裂，而是在第二次核分裂后才进行胞质分裂，如蚕豆、聚合草等。

2.减数分裂Ⅱ

（1）前期Ⅱ：染色体缩短变粗，染色体开始清晰起来。每个染色体含有一个着丝粒和纵向排列的两条染色单体。前期快结束，染色体更短粗，核膜消失。

（2）中期Ⅱ：染色体排列在赤道面上，每个染色体含一个着丝粒、两条染色单体。两条染色单体开始分离。此时细胞的染色体数为n，每一个染色体有两条染色单体。

（3）后期Ⅱ：两条染色单体分离，移向两极，每极含n条染色体。

（4）末期Ⅱ：染色体逐渐解螺旋，变为细丝状，核膜重建，核仁重新形成。胞质分裂，各成为两个子细胞。

【要点及注意事项】

（1）蝗虫采集以九月份正处于交配期的雄蝗虫为最好，此时性母细胞大量分裂，容易观察到减数分裂的全过程。

（2）在精巢中选择比较粗圆的曲精细管，并挑选细胞分裂旺盛的前半段曲精细管进行染色观察。尽量不要选择近输精管的后半段，因该段属于转化区内，主要含成熟精子和精细胞。

（3）压片材料要少，尽量利用解剖针挤出性母细胞。避免大量细胞在一起不利于观察。

【作业及思考题】

（1）取材时间的早晚是本实验成功与否的关键，请总结玉米及蝗虫适时取样的要点。

（2）根据细胞分裂过程，以两对同源染色体为例，归纳减数分裂与有丝分裂的区别。

（3）在减数分裂的观察中，一般不需要对材料进行预处理，为什么？

【参考文献】

[1] 杨大翔.遗传学实验[M].第3版.北京：科学出版社，2016.

[2] 闫桂琴，王华峰.遗传学实验教程[M].北京：科学出版社，2010.

[3] 赵凤娟，姚志刚.遗传学实验[M].第2版.北京：化学工业出版社，2016.

[4] 卢龙斗，常重杰.遗传学实验技术[M].北京：科学出版社，2007.

（唐文武　陈刚）