1 材料与方法

1.1 实验动物

健康Sprague-Dawley大白鼠30只，雄、雌各半，体重200～220g。随机分成5个实验组，每组6只，雄雌各半。实验前检疫1周，整个实验过程中，动物自由摄食饮水，室温20～22℃，相对湿度70%～85%。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器

ABI 9700型PCR基因扩增仪（ABI公司，美国）

310型DNA测序仪（ABI公司，美国）

1.2.2 主要试剂

TETS纯品（98.5%）试剂

TRIzol 100ml（GIBCO公司，美国）

RT-PCR试剂盒（SuperScriptTM one-step RT-PCR with Platinum Taq）100 reactions（GIBCO公司，美国）

1.3 实验方法

1.3.1 建立四个不同剂量毒鼠强中毒大鼠模型及对照组。在濒死期或实验结束时断颈处大鼠，解剖提取各中毒组与对照组大鼠的脑皮质、脑干

1.3.2 采用TRIzol快速法提取各组织mRNA

1.3.3 多重复合荧光RT-PCR建立

1.3.3.1 引物的合成

对bcl-2/bax引物的设计参考文献，由上海生物技术工程公司合成。其中，在bcl-2、bax基因座sense primer 5’端挂6-FAM；管家基因β-actin基因座sense primer 5′端挂HEX。

bcl-2: sense primer: 5' - FAM-ctg tac ggc ccc agc atg cg -3’

antisense primer: 5' - gct ttg ttt cat ggt aca tc -3’

bax: sense primer: 5' - FAM- ggg aat tct gga gct gca gag gat gat t -3’

antisense primer: 5' - gcg gat cca agt tgc cat cag caa aca t -3’

β-actin: sense primer: 5' - HEX-gca gtt ggt tgg agc aa-3’

antisense primer: 5' - atg ccg tgg ata ctt gga-3’

1.3.3.2 一步法RT-PCR扩增法的建立

采用一步法逆转录及PCR反应，反应体系10μl。内含RNA模板4μl, 2×反应Buffer 1μl（内含有dNTP）, 50mM Mg++ 0.45μl; Bcl-2浓度为0.4μmol/L, Bax浓度为0.3μmol/L; β-actin浓度为0.15μmol/L; RT/Platinum Taq混合酶0.2μl，加Rnase-free的Milli-Q超纯水补足至10μl。PCR扩增条件：50℃×45min×1cycle; 95℃×2min×1cycle, 95℃×1min, 58℃×1min, 72℃×2min，共30cycles; 72℃×10min。然后，4℃保存

1.3.4 应用ABI 310型DNA测序仪上的Genescan analysis 2.1 version软件，通过与ROX-500标准分子量大小比对，确定bcl-2、bax、β-actin基因mRNA转化的PCR产物，并记录测出每个特异性峰的峰高和峰面积

1.4 统计学方法

应用t检验，比较不同TETS中毒剂量、不同部位的脑组织bcl-2、bax、β-actin基因mRNA表达的差异与变化。