2. 原生质体　植株再生

在试管或玻璃瓶里培养一小块植物组织或器官，可以迅速再生为完整植株，那么培养任意一个植物体细胞能不能再生完整植株呢？从理论上说，完全可以。因为植物细胞具有全能性，除了极个别不含细胞核的体细胞外（如植物韧皮部的营养运输细胞），每一个体细胞都含有它所属的植物生命活动需要的全部基因，只要条件适宜，都可以作为种子细胞，具有发育成完整植株的潜能。

但是与动物细胞不同，植物细胞被一层坚硬而富有弹性的细胞壁包裹着。这层厚厚的细胞壁使植物细胞变得十分“慵懒”，妨碍了全能性的发挥。假如除去这层细胞壁，或许植物体细胞会像种子那样，种下去就会长出小苗。问题是，该怎样除去细胞壁呢？

早在1892年，生物学家克勒科尔首先用机械方法除去了藻类的细胞壁。他将细胞放在高浓度的糖溶液中，结果细胞壁和细胞质发生了分离，弄碎细胞壁终于获得了裸露的细胞。这种裸露植物细胞又叫原生质体。后来许多科学家试图用这种方法制备原生质体，遗憾的是，利用这种方法制备原生质体产量极低，而且很多类型的细胞根本无法用这种方法获得原生质体。

20世纪60年代初，英国诺丁汉大学的科金教授用纤维素酶消化番茄幼苗根尖细胞的细胞壁，结果获得了大量原生质体。酶法的好处是，制备的原生质体量大，且不容易破裂。目前用这种方法几乎能从植物的任何部位分离出大量原生质体，如叶片、花、果实、根、肿瘤组织以及体外培养的愈伤组织或细胞。一般来说，用叶肉组织制备的原生质体遗传性状比较一致，而体外培养的组织或细胞无论是遗传性状还是生理状态差异都很大，最好不要用来进行育苗。

由于酶法制备原生质体的优越性，后来这种方法获得了很大发展，到了21世纪在植物细胞工程领域仍在广泛应用。在实践中，常用的工具酶有纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和胼胝质酶等。纤维素酶是从一种称为绿色木霉的真菌中提取的复合型酶制剂。果胶酶则是从另一种真菌—根霉中提取的，它能把细胞从组织中分离出来。蜗牛酶和胼胝质酶对花粉母细胞的消化效果较好。有的酶制剂中含有许多杂质，如酚类、核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶等，这些杂质既降低了酶活力，又对制备的原生质体有毒害作用。

在获得了大量有活力的原生质体后，就可以用培养基来培养了。原生质体可以用固体培养法培养，即把制备的原生质体均匀地固定于琼脂培养基中。具体操作时，先配制高浓度的固体琼脂培养基，然后加热溶化，再冷却至45℃，与制备好的等量原生质体悬浮液一起倒入直径6厘米的玻璃培养皿内，接着迅速而轻轻地摇动培养皿，使原生质体均匀地分散在琼脂培养基中，用胶带密封好，再放入直径9厘米的玻璃培养皿中，里面放置湿的无菌滤纸，以保持一定湿度。这种培养法的优点是便于定点观察一个原生质体的生长发育过程。首次培养成功的烟草叶肉原生质体植株采用的就是这种方法。

原生质体也可以用液体培养法培养。它是把纯化后的原生质体悬浮在液体培养基中，可作液体浅层培养或悬滴培养。由于原生质体易沉淀到培养瓶底部，每天需要摇动几次，以利于通气。这种方法生长速度较快，但当细胞分裂成细胞团时，需要转移到固体培养基中，这样才能使细胞继续增殖或诱导分化成幼苗。

原生质体还可以用双层培养法培养。首先把原生质体悬浮于液体培养基中，然后转移到固体培养基上。液体与固体培养基相结合，能保持较好的湿度，在培养过程中需要定期加入新鲜培养液，这样更有利于原生质体生长。

在原生质体发育过程中，首先是细胞壁再生。原生质体来源的植物不同，细胞壁再生的速度也不一样，比如，有的蚕豆属植物，在分离原生质体后10～20分钟细胞壁已开始合成，而烟草叶的原生质体要经过3～24小时才开始合成细胞壁。另外，幼嫩的植物细胞合成细胞壁速度较快，成熟的细胞则慢一些。原生质体长出细胞壁后，已成为新的植物细胞，经过多次分裂后形成细胞团。细胞团继续分裂增殖，形成愈伤组织。愈伤组织经过诱导后，长出幼芽幼根，进一步发育成植株。

迄今，不少植物如胡萝卜、油菜、马铃薯、水稻、小麦、木薯、草莓、苹果等的原生质体植株再生都获得了成功，一些真菌、细菌的原生质体再生也取得了重要进展。2013年，王昱等报道了灵芝原生质体再生。2015年，卢月霞等报道了鸡腿菇原生质体再生，孙玲等报道了反硝化聚磷菌N14的原生质体再生，杨子萱等报道了鼠李糖乳杆菌的原生质体制备和再生。2016年，贾瑞博等报道了高粱红曲菌M-3原生质体制备和再生。这些研究成果，都具有潜在的应用价值。